Kaffeeeffekt bei HCV-bedingter Hepatitis

Patienten Vierzig Patienten mit HCV-bedingter chronischer Lebererkrankung, die sich an die Gastroenterologie-Abteilung der Ambulanz von Padua wenden, werden prospektiv rekrutiert und nehmen an der Studie teil.

Bei allen Patienten wird das Vorhandensein von Anti-HCV-Antikörpern durch einen immunoenzymatischen Test der dritten Generation (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) und durch einen Bestätigungstest (rekombinanter Immunblotting-Assay, Chiron Corp., Emeryville, CA) bestimmt. Es wird ein standardisierter Genotypisierungstest (Inno-Lipa HCV III, Innogenetics, Gent, Belgien) verwendet.

Es werden nur Patienten rekrutiert, die die folgenden Einschlusskriterien erfüllen:

• HCV-bedingte chronische Hepatitis oder Zirrhose, mit bioptischer (innerhalb der letzten 24 Monate) Bestätigung oder einer klinischen Diagnose im Falle einer Zirrhose; (Prothrombinzeit – PT, weiße Blutkörperchen – WBC und Blutplättchen – PLT, Ultraschall – US-Untersuchung);
• Anti-HCV- und HCV-RNA-Positivität mit Aspartataminotransferase (AST)/Alaninaminotransferase (ALT) mindestens 1,5x;
• Altersspanne 30-80 Jahre;
• keine laufende Interferonbehandlung, vorherige Behandlung ohne Ansprechen oder Rückfall wurde akzeptiert.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Krankenhauses (Prot. 1755 P, Azienda Ospedaliera di Padova) ist die Teilnahme der Patienten freiwillig und jeder Patient unterzeichnet eine Einverständniserklärung zur Teilnahme, wobei dem behandelnden Hausarzt jedes Patienten ein Informationsschreiben ausgehändigt wird.

Vor Beginn der Interventionsphase werden für jeden Patienten demografische Daten sowie Informationen zu Kaffee- und Rauchgewohnheiten, Alkohol-, Obst- und Gemüsekonsum, entzündungshemmendem Medikamentenkonsum sowie Energie- und Nährstoffaufnahme als mögliche Verzerrung erhoben. Alle diese Daten werden mithilfe eines Quantitäts-Häufigkeits-Fragebogens ausgewertet, der für die Verwendung in der vorliegenden Studie entwickelt wurde. Zum Zeitpunkt 0 (T0) werden die Patienten in Bezug auf ihren routinemäßigen Kaffeekonsum in zwei Gruppen eingeteilt: 0–2 Tassen/Tag und 3–5 Tassen/Tag. Dieser Grenzwert wurde gewählt, da in den meisten Arbeiten ein Effekt des Kaffeekonsums bei mehr als 2 Tassen/Tag beobachtet wird.

Die Probanden werden gebeten, während der gesamten Studie ihre Ernährungs- und Lustgewohnheiten beizubehalten, während der Konsum anderer koffeinhaltiger Getränke verboten ist.

Versuchsdesign der Studie

Die Patienten werden zu Beginn der Studie (T0) auf alle Marker untersucht und dann mithilfe einer computergenerierten Liste (Statistikprogramm StatsDirect) in zwei Gruppen randomisiert, mit entweder 4 Kaffeetassen/Tag Einnahme für 1 Monat oder Abstinenz für die gleichen Zeitraum. Offensichtlich ist eine Verblindung nicht möglich und wir haben beschlossen, keine Auswaschphase vorzuschreiben, sondern die T0-Probenahme im Verhältnis zum routinemäßigen Kaffeekonsum der Patienten zu untersuchen.

Nach 30 Tagen werden die Patienten erneut getestet, dann auf die entgegengesetzte „Behandlung“ umgestellt (in den Kaffeearm diejenigen, die im ersten Monat abstinent waren und umgekehrt diejenigen, die Kaffee konsumierten) und nach dem zweiten Mal erneut untersucht Zeitraum.

Jeder Patient wird daher dreimal getestet, bei T0, wenn er/sie in die Studie eintritt, nach dem Kaffee und nach der Abstinenz, wobei jeder Patient in den beiden Phasen die Kontrolle über sich selbst hat. Der Einfachheit halber werden alle nach dem Kaffeekonsum gewonnenen Daten mit allen während der Abstinenz gewonnenen Daten verglichen, unabhängig von der zeitlichen Abfolge der Exposition/Abstinenz.

Unter Berücksichtigung (auf der Grundlage veröffentlichter Daten) eines erwarteten Kaffeeeffekts bei mindestens 40 % der exponierten Probanden, mit 1 Kontrolle pro Fall, mit 5 % Alpha-Fehler und mit 80 % Power, ist die erforderliche Stichprobengröße (20 Fälle und 20 Kontrollen) entsprach der für die Studie ausgewählten Stichprobe. Aufgrund des Cross-Over-Designs, bei dem jeder Patient zweimal untersucht wird, einmal während der Kaffeeexposition und einmal während der Abstinenz, beträgt die tatsächliche Anzahl der untersuchten Patienten in dieser Studie außerdem 40 pro Arm und ist damit doppelt so hoch wie erforderlich.

Den Patienten wird ein Formular ausgehändigt, in dem sie etwaige Abweichungen und Compliance in Bezug auf den Kaffeekonsum notieren, sowie geeignete Telefonkontakte, um etwaige Nebenwirkungen umgehend zu melden. Um das Risiko einer Verzerrung aufgrund interindividueller Veränderungen bei der Kaffeezubereitung zu verringern, wird den Patienten eine typisch italienische Kaffeemaschine vom Herdtyp (MokaTMBialetti) zur Verfügung gestellt, die die für die Zubereitung erforderliche Kaffeemenge bereitstellt die 4 Kaffeetassen/Tag (8 g für jede Kaffeezubereitung) und eine Anleitung zur Zubereitung.

Die Kaffeemarke ist ein 100 % Coffea Arabica-Produkt aus dem Regal. Wir wollen auch das von uns verwendete Produkt analysieren. Die Analysen werden von einem Vertragslabor (Eurofins analytic GmbH – Hamburg-Deutschland) durchgeführt.

Die Patienten wurden angewiesen, keinen anders zubereiteten Kaffee zu trinken und mussten jede Abweichung von der Studie in geeigneter Form melden.

Methoden Blutproben werden entnommen und nicht länger als 3 Wochen bei -20 °C gelagert.

In dieser Studie werden folgende Parameter ausgewertet:

1. AST/ALT-, Gammaglutamyl-Transpeptidase (γGT)- und alkalische Phosphatase (ALP)-Spiegel;
2. Viruslast (HCV-RNA-Titer),
3. Marker für oxidativen Schaden: 8-Hydroxydesoxyguanosin (8-OHdG), Stickoxid (NO), Advanced Oxidation Protein Products (AOPP),
4. Marker der genomischen Stabilität: Telomerlänge (TL),
5. Zelltodmarker: M30 und M30/M65,
6. Marker für Leberfibrose und Angiogenese: Prokollagen Typ III (PIIINP) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).

Bestimmung der Leberfunktionstests Die Serumspiegel von AST und ALT, GammaGT und ALP werden im Rahmen des routinemäßigen klinischen Verfahrens bestimmt.

HCV-RNA-Bestimmung Das Vorhandensein von HCV-RNA im Serum wird durch Amplifikation mit PCR der 5'-untranslatierten Region (5'-UTR) von HCV, der am stärksten konservierten Region des Virus, beurteilt. Der Test wird bei allen Probanden durchgeführt, die positiv auf Anti-HCV-Antikörper sind (Screening-Test). Die Amplifikation wird in zwei Schritten durch „nested PCR“ durchgeführt.

8-OHdG-Bestimmung Dieser Test wird wie folgt durchgeführt: Kurz gesagt besteht dieser Test aus drei Schritten: (i) genomische DNA-Extraktion unter Verwendung eines Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Italia, Mailand); (ii) Nuklease P1 und alkalische Phosphatase-Hydrolyse von DNA; (iii) 8-OHdG-Bestimmung mittels HPLC, ausgestattet mit einem elektrochemischen Detektor (HPLC-ED) (ESA Coulochem II 5200 A, Bedford, MA). Die 8-OHdG-Gehalte werden als Anzahl der 8-OHdG-Addukte/105 dG ausgedrückt.

NO-Bestimmung Der NO-Spiegel im Serum wird spektrophotometrisch bestimmt, indem die Akkumulation seiner stabilen Abbauprodukte Nitrat und Nitrit gemessen wird (Oxford Biomedical Research, USA). Der NO-Gehalt wird in µmol/L ausgedrückt und dient als Marker für die Aktivierung und Nitrosierung der Stickoxidsynthase.

AOPP-Bestimmung Die Plasma-AOPP-Spiegel werden mit der von Witko-Sarsat durchgeführten spektrophotometrischen Methode gemessen. AOPP-Konzentrationen werden als µmol/L Chloramin-T-Äquivalente ausgedrückt.

TL-Analyse durch quantitative PCR Die extrahierte genomische DNA wird auch zur Messung des TL mithilfe der von Cawthon entwickelten Methode verwendet. Für jedes Experiment wurden zwei 96-Well-Platten vorbereitet, eine mit Telomerprimern und die andere für 36B4, das für das saure ribosomale Phosphoprotein P0 kodiert, das als Einzelkopie-Gen verwendet wird.

Jede 25-µl-PCR-Reaktion umfasste 40 ng DNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) und Primer in Endkonzentrationen von 270 nM Tel-1 und 900 nM Tel-2 bzw. 300 nM 36B4u und 500 nM 36B4d.

Die PCR-Amplifikation wird in einem ABI PRISM 7900 (Applied Biosystem) durchgeführt. In jeder Platte wird eine Standardkurve im Bereich von 4 bis 80 ng menschlicher Referenz-DNA (Applied Biosystem) erstellt. Das thermische Zyklenprofil für die Telomerverstärkung beträgt 10 Minuten lang 95 °C, gefolgt von 30 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden, 56 °C für 10 Sekunden und 72 °C für 60 Sekunden oder 30 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden s, 58°C für 10 s und 72°C für 40 s. Nach der Amplifikation wird eine Dissoziationskurve erstellt, um die Spezifität der Reaktion zu bestätigen. Alle Proben werden dreifach getestet, um die Reproduzierbarkeit des Tests zu testen. Bei jedem Test wird eine Negativkontrolle ausgewertet.

Fluoreszenzsignale und Dissoziationskurven werden mit der Software ABI 7900 SDS 2.3 analysiert.

Bestimmung des Zelltods Der M30-Apoptosense ELISA (Peviva, USA) ist ein einstufiger In-vitro-Immunoassay zur quantitativen Bestimmung des Apoptose-assoziierten CK18Asp396 (M30)-Neo-Epitops im Plasma. Die Konzentration des Antigens, die den anhaltenden apoptotischen Zelltod quantifiziert, wird als U/L ausgedrückt.

Der M30-Apoptosense-ELISA wird in Kombination mit dem M65-ELISA (Peviva, USA) zur quantitativen Bestimmung des gesamten löslichen CK18 verwendet, das aus toten Zellen (nekrotisch und apoptotisch) freigesetzt wird. Die Konzentration des Antigens wird in U/L ausgedrückt.

PIIINP- und VEGF-Bestimmung Die Plasma-PIIINP-Spiegel werden mit dem ELISA-Kit (USCN, China) bestimmt. PIIINP-Spiegel werden in ng/ml ausgedrückt und dienen als Marker für die Kollagenablagerung und Fibrose im Gewebe. Serum-VEGF wird als Marker für Neoangiogenese und Geweberemodellierung mithilfe eines ELISA-Kits (Bender MedSystems, Österreich) bestimmt, wobei die Daten in ng/L ausgedrückt werden.

Statistische Daten werden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA, eines gepaarten T-Tests, eines Student-T-Tests für ungepaarte Daten und einer linearen Regression (SPSS, STATSDIRECT) mit einer statistischen Signifikanz von p <0,05 (zweiseitig) analysiert. Alle Vergleiche hinsichtlich Kaffeeexposition und Abstinenz werden innerhalb von Patienten und nicht innerhalb von Gruppen durchgeführt, wobei, wie gesagt, ein Paardatenansatz verwendet wird.