Efekt kawy w zapaleniu wątroby związanym z HCV

Pacjenci Czterdziestu pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby związaną z zakażeniem HCV, zgłaszających się do ambulatorium Oddziału Gastroenterologii w Padwie, zostanie zrekrutowanych prospektywnie i zostanie włączonych do badania.

U wszystkich pacjentów obecność przeciwciał anty-HCV zostanie oznaczona testem immunoenzymatycznym trzeciej generacji (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) oraz testem potwierdzającym (recombinant immunoblotting assay, Chiron Corp., Emeryville, CA). Zastosowany zostanie standaryzowany test genotypowania (Inno-Lipa HCV III, Innogenetics, Gent, Belgia).

Zostaną zrekrutowani tylko pacjenci, którzy spełniają następujące kryteria włączenia:

• przewlekłe zapalenie wątroby lub marskość wątroby związane z HCV, z potwierdzeniem bioptycznym (w ciągu ostatnich 24 miesięcy) lub rozpoznaniem klinicznym w przypadku marskości wątroby; (Czas protrombinowy - PT, Krwinki Białe - WBC i płytki krwi - PLT, Ultradźwięki - badanie USG);
• dodatni wynik anty-HCV i HCV-RNA z aminotransferazą asparaginianową (AST)/aminotransferazą alaninową (ALT) co najmniej 1,5x;
• przedział wiekowy 30-80 lat;
• brak trwającego leczenia interferonem, zaakceptowano wcześniejsze leczenie bez odpowiedzi lub nawrót choroby.

Badanie zostało zatwierdzone przez Szpitalną Komisję Etyczną (Prot. 1755 P, Azienda Ospedaliera di Padova), udział pacjentów jest dobrowolny i każdy pacjent podpisuje świadomą zgodę na udział, a notatka informacyjna jest dostarczana lekarzowi pierwszego kontaktu każdego pacjenta.

Przed rozpoczęciem fazy interwencji dla każdego pacjenta zostaną zebrane dane demograficzne wraz z informacjami na temat nawyków związanych z kawą i paleniem, spożywaniem alkoholu, owoców, warzyw, leków przeciwzapalnych, spożycia energii i składników odżywczych jako potencjalnego błędu. Wszystkie te dane zostaną ocenione za pomocą kwestionariusza ilościowo-częstotliwościowego zaprojektowanego do wykorzystania w niniejszym badaniu. W czasie 0 (T0) pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy w zależności od ich rutynowego spożycia kawy: 0-2 filiżanki dziennie i 3-5 filiżanek dziennie. Wybrano tę wartość graniczną, ponieważ w większości prac obserwuje się efekt spożycia kawy powyżej 2 filiżanek dziennie.

Osoby badane zostaną poproszone o zachowanie przez cały czas swoich nawyków żywieniowych i zmysłowych, przy jednoczesnym zakazie spożywania innych napojów zawierających kofeinę.

Próbny projekt badania

Pacjenci zostaną zbadani pod kątem wszystkich markerów na początku badania (T0), a następnie losowo przydzieleni za pomocą wygenerowanej komputerowo listy (program statystyczny StatsDirect) do dwóch grup, z 4 filiżankami kawy dziennie przez 1 miesiąc lub abstynencją przez 1 miesiąc. ten sam okres czasu. Oczywiście zaślepienie nie jest możliwe i zdecydowaliśmy się nie zalecać żadnego okresu wypłukiwania, jakim jest próbkowanie T0 badane w odniesieniu do rutynowego spożycia kawy przez pacjentów.

Po 30 dniach pacjenci zostaną ponownie przebadani, a następnie przeniesieni do przeciwnego „leczenia” (do ramienia kawowego ci, którzy byli abstynentami w pierwszym miesiącu i odwrotnie ci, którzy pili kawę) i ponownie sprawdzeni po drugim razie okres.

Dlatego każdy pacjent jest badany trzykrotnie, w T0, kiedy wchodzi do badania, po kawie i po abstynencji, będąc w obu fazach kontrolą każdego pacjenta. Dla uproszczenia wszystkie dane uzyskane po spożyciu kawy zostaną porównane ze wszystkimi danymi uzyskanymi podczas abstynencji, niezależnie od sekwencji czasowej ekspozycji/abstynencji.

Biorąc pod uwagę (na podstawie opublikowanych danych) oczekiwany efekt kawy u co najmniej 40% narażonych osób, z 1 kontrolą na przypadek, z 5% błędem alfa i 80% mocą, wymagana wielkość próby (20 przypadków i 20 kontroli) odpowiadały wybranej próbie do badań. Dodatkowo, w tym badaniu, biorąc pod uwagę projekt krzyżowy, w którym każdy pacjent jest badany dwukrotnie, raz podczas ekspozycji na kawę i raz podczas abstynencji, rzeczywista liczba badanych pacjentów wynosi 40 na ramię, a zatem dwa razy więcej niż jest to wymagane.

Pacjenci otrzymają formularz, w którym odnotowali wszelkie odstępstwa i przestrzeganie zasad spożywania kawy oraz odpowiednie kontakty telefoniczne w celu natychmiastowego zgłoszenia ewentualnych skutków ubocznych. Aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia jakichkolwiek uprzedzeń wynikających z międzyindywidualnych zmian w przygotowywaniu kawy, pacjenci otrzymają typowy włoski ekspres do kawy typu kuchenka (MokaTMBialetti), potrzebną ilość kawy do przygotowania 4 filiżanki kawy dziennie (8 g na każde przygotowanie kawy) oraz instrukcje dotyczące jej przygotowania.

Marka kawy to 100% Coffea arabica produkt z półki. Chcemy również przeanalizować produkt, którego używamy. Analizy będą wykonywane przez laboratorium kontraktowe (Eurofins analytic GmbH - Hamburg-Niemcy).

Pacjenci zostali poinstruowani, aby nie pić inaczej przygotowanej kawy i musieli zgłaszać w odpowiedniej formie każde odstępstwo od badania.

Metody Próbki krwi będą pobierane i przechowywane w temperaturze -20°C nie dłużej niż 3 tygodnie.

W tym badaniu oceniane będą następujące parametry:

1. poziomy AST/ALT, gammaglutamylo-transpeptydazy (γGT) i fosfatazy alkalicznej (ALP);
2. miano wirusa (miano HCV-RNA),
3. markery uszkodzeń oksydacyjnych: 8-hydroksydeoksyguanozyna (8-OHdG), tlenek azotu (NO), Advanced Oxidation Protein Products (AOPP),
4. marker stabilności genomu: długość telomerów (TL),
5. markery śmierci komórkowej: M30 i M30/M65,
6. markery włóknienia wątroby i angiogenezy: prokolagen typu III (PIIINP) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF).

Oznaczanie testów czynnościowych wątroby Poziomy AST i ALT, gammaGT i ALP w surowicy będą oznaczane w ramach rutynowej procedury klinicznej.

Oznaczanie HCV-RNA Obecność HCV-RNA w surowicy będzie oceniana przez amplifikację za pomocą PCR nieulegającego translacji regionu 5' (5'-UTR) HCV, najbardziej konserwatywnego regionu wirusa. Badanie wykonuje się u wszystkich osób z dodatnim wynikiem badania na przeciwciała anty-HCV (badanie przesiewowe). Amplifikacja zostanie przeprowadzona w dwóch etapach, za pomocą „zagnieżdżonej PCR”.

Oznaczanie 8-OHdG Ten test zostanie przeprowadzony w następujący sposób: w skrócie, ten test składa się z 3 etapów: (i) ekstrakcja genomowego DNA przy użyciu zestawu Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Italia, Milano); (ii) hydroliza DNA przez nukleazę P1 i fosfatazę alkaliczną; (iii) oznaczanie 8-OHdG przy użyciu HPLC wyposażonej w detektor elektrochemiczny (HPLC-ED) (ESA Coulochem II 5200 A, Bedford, MA). Poziomy 8-OHdG wyrażono jako liczbę adduktów 8-OHdG/105 dG.

Oznaczanie NO Stężenia NO w surowicy będą oznaczane spektrofotometrycznie poprzez pomiar akumulacji jego stabilnych produktów degradacji, azotanów i azotynów (Oxford Biomedical Research, USA). Poziomy NO będą wyrażane w µmol/L, jako marker aktywacji i nitrozowania syntazy tlenku azotu.

Oznaczanie AOPP Stężenie AOPP w osoczu będzie mierzone metodą spektrofotometryczną wykonaną przez firmę Witko-Sarsat. Stężenia AOPP wyrażono jako µmol/L równoważników chloramin-T.

Analiza TL metodą ilościowego PCR Wyekstrahowany genomowy DNA zostanie wykorzystany również do pomiaru TL metodą opracowaną przez Cawthona. Do każdego eksperymentu przygotowano dwie 96-studzienkowe płytki, jedną zawierającą startery telomerowe, a drugą dla 36B4, kodującego kwaśną rybosomalną fosfoproteinę P0, stosowaną jako gen pojedynczej kopii.

Każda 25 µl reakcji PCR zawierała 40 ng DNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) i startery w końcowych stężeniach odpowiednio 270 nM Tel-1 i 900 nM Tel-2 lub 300 nM 36B4u i 500 nM 36B4d.

Amplifikację PCR przeprowadza się w ABI PRISM 7900 (Applied Biosystem). Na każdej płytce tworzona jest standardowa krzywa w zakresie od 4 do 80 ng ludzkiego referencyjnego DNA (Applied Biosystem). Profil cykli termicznych dla amplifikacji telomerów wynosi 95°C przez 10 min, następnie 30 cykli w 95°C przez 5 s, 56°C przez 10 s i 72°C przez 60 s lub 30 cykli w 95°C przez 5 s, 58°C przez 10 s i 72°C przez 40 s. Po amplifikacji wykonuje się krzywą dysocjacji w celu potwierdzenia specyficzności reakcji. Wszystkie próbki są badane w trzech powtórzeniach w celu zbadania odtwarzalności testu iw każdym teście oceniana jest kontrola negatywna.

Sygnały fluorescencji i krzywe dysocjacji są analizowane przez oprogramowanie ABI 7900 SDS 2.3.

Oznaczanie śmierci komórek M30-Apoptosense ELISA (Peviva, USA) jest jednoetapowym testem immunologicznym in vitro do ilościowego oznaczania związanego z apoptozą neo-epitopu CK18Asp396 (M30) w osoczu. Stężenie antygenu, które określa ilościowo trwającą apoptotyczną śmierć komórki, wyraża się jako U/L.

Test M30-Apoptosense ELISA jest stosowany w połączeniu z M65 ELISA (Peviva, USA) do ilościowego oznaczania całkowitego rozpuszczalnego CK18 uwolnionego z martwych komórek (nekrotycznych i apoptotycznych). Stężenie antygenu wyraża się jako U/l.

Oznaczanie PIIINP i VEGF Poziomy PIIINP w osoczu zostaną określone przy użyciu zestawu ELISA (USCN, Chiny). Poziomy PIIINP wyrażono w ng/ml jako markera odkładania się kolagenu w tkance i zwłóknienia. VEGF w surowicy zostanie określony jako marker neoangiogenezy i przebudowy tkanki przy użyciu zestawu ELISA (Bender MedSystems, Austria), dane wyrażone w ng/l.

Dane statystyczne zostaną przeanalizowane przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA, sparowanego testu t, testu t-Studenta dla danych niesparowanych, regresji liniowej (SPSS, STATSDIRECT) ze statystyczną istotnością ustawioną na p <0,05 (dwustronna). Wszystkie porównania dotyczące narażenia na kawę i abstynencji będą przeprowadzane w obrębie pacjentów, a nie w obrębie grup, przy użyciu, jak powiedziano, podejścia opartego na danych w parach.