Účinek kávy u hepatitidy související s HCV

Pacienti Do studie bude prospektivně přijato 40 pacientů s chronickým onemocněním jater souvisejícím s HCV, kteří se odkazují na ambulantní kliniku gastroenterologické jednotky v Padově.

U všech pacientů bude přítomnost anti-HCV protilátek testována imunoenzymatickým testem třetí generace (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) a konfirmačním testem (rekombinantní imunoblotovací test, Chiron Corp., Emeryville, CA). Bude použit standardizovaný genotypizační test (Inno-Lipa HCV III, Innogenetics, Gent, Belgie).

Budou přijati pouze pacienti, kteří splňují následující kritéria pro zařazení:

• chronická hepatitida nebo cirhóza související s HCV s bioptickým (během předchozích 24 měsíců) potvrzením nebo klinickou diagnózou v případě cirhózy; (Protrombinový čas - PT, Bílé krvinky - WBC a krevní destičky - PLT, Ultrazvuk - US vyšetření);
• pozitivita anti-HCV a HCV-RNA s aspartátaminotransferázou (AST)/alaninaminotransferázou (ALT) alespoň 1,5x;
• věkové rozmezí 30-80 let;
• žádná pokračující léčba interferonem, předchozí léčba bez odpovědi nebo relapsu byla akceptována.

Studie je schválena nemocniční etickou komisí (Prot. 1755 P, Azienda Ospedaliera di Padova), účast pacientů je dobrovolná a každý pacient podepisuje informovaný souhlas s účastí, přičemž informativní zpráva je doručena ošetřujícímu praktickému lékaři každého pacienta.

Před zahájením intervenční fáze budou u každého pacienta shromážděna demografická data spolu s informacemi o kávě a kuřáckých návycích, konzumaci alkoholu, ovoce, zeleniny, protizánětlivých léků, příjmu energie a živin jako potenciální zkreslení. Všechna tato data budou vyhodnocena pomocí kvantitativního-frekvenčního dotazníku navrženého pro použití v této studii. V čase 0 (T0) budou pacienti rozděleni do dvou skupin podle jejich běžného příjmu kávy: 0-2 šálky/den a 3-5 šálků/den. Tato hranice byla zvolena, protože ve většině prací je pozorován účinek konzumace kávy při více než 2 šálcích/den.

Subjekty budou požádány, aby po celou dobu studie udržovaly své stravovací a chuťové návyky, zatímco použití jiných nápojů obsahujících kofein je zakázáno.

Zkušební návrh studie

Pacienti budou vyšetřeni na všechny markery na začátku studie (T0) a poté budou randomizováni pomocí počítačem generovaného seznamu (statistický program StatsDirect) do dvou skupin, buď s příjmem 4 šálků kávy/den po dobu 1 měsíce, nebo s abstinencí. stejné časové období. Je zřejmé, že zaslepení není možné a rozhodli jsme se nepředepisovat žádné vymývací období, protože odběr vzorků T0 byl zkoumán ve vztahu k běžné konzumaci kávy pacientů.

Po 30 dnech budou pacienti znovu testováni a poté převedeni na opačnou „léčbu“ (do kávového ramene ti, kteří byli v prvním měsíci abstinenti a naopak ti, kteří kávu konzumovali) a znovu zkontrolováni po druhé léčbě. doba.

Každý pacient je proto testován třikrát, v T0, když vstupuje do studie, po kávě a po abstinenci, přičemž každý pacient je ve dvou fázích sám nad sebou. Pro zjednodušení budou všechna data získaná po konzumaci kávy porovnána se všemi daty získanými během abstinence, bez ohledu na časovou posloupnost expozice/abstinence.

Vezmeme-li v úvahu (na základě publikovaných údajů) očekávaný efekt kávy u nejméně 40 % exponovaných subjektů, s 1 kontrolou pro případ, s 5 % alfa chybou a s 80 % silou, požadovaná velikost vzorku (20 případů a 20 kontrol) odpovídaly vybranému vzorku pro studii. Navíc v této studii, vzhledem ke zkříženému designu, ve kterém je každý pacient vyšetřován dvakrát, jednou během expozice kávě a jednou během abstinence, je skutečný počet vyšetřovaných pacientů na rameno 40, tedy dvakrát více, než je požadováno.

Pacienti obdrží formulář, ve kterém zaregistrují jakoukoli odchylku a shodu s ohledem na příjem kávy a příslušné telefonní kontakty, aby mohli okamžitě hlásit jakýkoli vedlejší účinek. Pro snížení rizika případného zkreslení v důsledku interindividuálních změn v přípravě kávy bude pacientům poskytnut typický italský kávovar sporákového typu (MokaTMBialetti), potřebné množství kávy pro přípravu kávy. 4 šálky kávy/den (8 g na každou přípravu kávy) a návod, jak ji připravit.

Značka kávy je 100% produkt Coffea arabica z regálu. Chceme také analyzovat produkt, který používáme. Analýzy budou provedeny smluvní laboratoří (Eurofins analytic GmbH - Hamburg-Německo).

Pacienti jsou instruováni, aby nepili jinak připravenou kávu a museli vhodnou formou hlásit jakoukoli odchylku od studie.

Metody Vzorky krve budou odebírány a skladovány při -20 °C po dobu ne delší než 3 týdny.

V této studii budou hodnoceny následující parametry:

1. hladiny AST/ALT, gamaglutamyl-transpeptidázy (γGT) a alkalické fosfatázy (ALP);
2. virová nálož (HCV-RNA titr),
3. markery oxidačního poškození: 8-hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG), oxid dusnatý (NO), Advanced Oxidation Protein Products (AOPP),
4. marker genomové stability: Telomere Length (TL),
5. markery buněčné smrti: M30 a M30/M65,
6. markery jaterní fibrózy a angiogeneze: prokolagen typu III (PIIINP) a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF).

Stanovení jaterních funkčních testů Sérové ​​hladiny AST a ALT, gamaGT a ALP budou stanoveny jako součást rutinního klinického postupu.

Stanovení HCV-RNA Přítomnost HCV-RNA v séru bude hodnocena amplifikací pomocí PCR 5' nepřeložené oblasti (5'-UTR) HCV, nejkonzervovanější oblasti viru. Test se provádí u všech subjektů pozitivních na protilátky anti-HCV (screeningový test). Amplifikace bude provedena ve dvou krocích, pomocí „nested PCR“.

Stanovení 8-OHdG Tento test bude proveden následovně: ve stručnosti, tento test sestává ze 3 kroků: (i) extrakce genomové DNA pomocí Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Italia, Milano); (ii) nukleázou P1 a alkalickou fosfatázovou hydrolýzou DNA; (iii) Stanovení 8-OHdG pomocí HPLC vybavené elektrochemickým detektorem (HPLC-ED) (ESA Coulochem II 5200 A, Bedford, MA). Hladiny 8-OHdG jsou vyjádřeny jako počet aduktu 8-OHdG/105 dG.

Stanovení NO Hladiny NO v séru budou stanoveny spektrofotometricky měřením akumulace jeho stabilních degradačních produktů, dusičnanů a dusitanů (Oxford Biomedical Research, USA). Hladiny NO budou vyjádřeny jako µmol/l, jako marker aktivace a nitrosace syntázy oxidu dusnatého.

Stanovení AOPP Hladiny AOPP v plazmě budou měřeny spektrofotometrickou metodou provedenou Witko-Sarsat. Koncentrace AOPP jsou vyjádřeny jako umol/l chloraminů-T ekvivalentů.

Analýza TL pomocí kvantitativní PCR Extrahovaná genomová DNA bude použita také k měření TL pomocí metody vyvinuté Cawthonem. Pro každý experiment byly připraveny dvě 96jamkové destičky, jedna obsahující telomerové primery a druhá pro 36B4, kódující kyselý ribozomální fosfoprotein PO použitý jako gen s jednou kopií.

Každá 25 ul PCR reakce zahrnovala 40 ng DNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a primery v konečných koncentracích 270 nM Tel-1 a ​​900 nM Tel-2 nebo 300 nM 36B4u a 500 nM 36B4d, v daném pořadí.

PCR amplifikace se provádí v ABI PRISM 7900 (Applied Biosystem). Na každé destičce se vytvoří standardní křivka v rozsahu od 4 do 80 ng lidské referenční DNA (Applied Biosystem). Profil tepelného cyklování pro amplifikaci telomer je 95 °C po dobu 10 minut, následuje 30 cyklů 95 °C po dobu 5 s, 56 °C po dobu 10 s a 72 °C po dobu 60 s nebo 30 cyklů po 95 °C po dobu 5 s, 58 °C po dobu 10 s a 72 °C po dobu 40 s. Po amplifikaci se provede disociační křivka, aby se potvrdila specifita reakce. Všechny vzorky se testují trojmo, aby se otestovala reprodukovatelnost testu a v každém testu se vyhodnotila negativní kontrola.

Fluorescenční signály a disociační křivky jsou analyzovány softwarem ABI 7900 SDS 2.3.

Stanovení buněčné smrti M30-Apoptosense ELISA (Peviva, USA) je jednokrokový in vitro imunotest pro kvantitativní stanovení neoepitopu CK18Asp396 (M30) v plazmě spojeného s apoptózou. Koncentrace antigenu, která kvantifikuje probíhající apoptotickou buněčnou smrt, je vyjádřena jako U/L.

M30-Apoptosense ELISA se používá v kombinaci s M65 ELISA (Peviva, USA) pro kvantitativní stanovení celkového rozpustného CK18 uvolněného z mrtvých buněk (nekrotických a apoptotických). Koncentrace antigenu je vyjádřena jako U/L.

Stanovení PIIINP a VEGF Hladiny PIIINP v plazmě budou stanoveny pomocí soupravy ELISA (USCN, Čína). Hladiny PIIINP jsou vyjádřeny jako ng/ml jako marker ukládání tkáňového kolagenu a fibrózy. Sérový VEGF bude určen jako marker neoangiogeneze a tkáňové remodelace pomocí soupravy ELISA (Bender MedSystems, Rakousko), data jsou vyjádřena v ng/l.

Statistická data budou analyzována pomocí jednocestné ANOVA, párového t-testu, Studentova t-testu pro nepárová data, lineární regrese (SPSS, STATSDIRECT) se statistickou významností nastavenou na p <0,05 (2-tailed). Všechna srovnání týkající se expozice kávě a abstinence budou prováděna v rámci pacientů, nikoli v rámci skupin, za použití, jak již bylo řečeno, přístupu párových dat.