Kaffeeffekt vid HCV-relaterad hepatit

Patienter Fyrtio patienter med HCV-relaterad kronisk leversjukdom som hänvisar till Gastroenterology Unit på Paduas poliklinik kommer att rekryteras prospektivt och kommer att delta i studien.

Hos alla patienter kommer närvaron av anti-HCV-antikroppar att analyseras genom ett tredje generationens immunoenzymatiskt test (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) och genom bekräftande test (rekombinant immunoblotting-analys, Chiron Corp., Emeryville, CA). En standardiserad genotypningsanalys (Inno-Lipa HCV III, Innogenetics, Gent, Belgien) kommer att användas.

Endast patienter som uppfyller följande inklusionskriterier kommer att rekryteras:

• HCV-relaterad kronisk hepatit eller cirros, med bioptisk (inom de föregående 24 månaderna) bekräftelse eller en klinisk diagnos vid cirros; (Protrombintid - PT, vita blodkroppar - WBC och blodplättar - PLT, Ultraljud - amerikansk undersökning);
• anti-HCV- och HCV-RNA-positivitet med aspartataminotransferas (AST)/alaninaminotransferas (ALT) minst 1,5 gånger;
• åldersintervall 30-80 år;
• ingen pågående interferonbehandling, tidigare behandling utan svar eller återfall accepterades.

Studien är godkänd av sjukhusets etiska kommitté (Prot. 1755 P, Azienda Ospedaliera di Padova), är patienternas deltagande frivilligt och varje patient undertecknar ett informerat samtycke till deltagande, ett informationsmeddelande levereras till varje patients behandlande allmänläkare.

Innan interventionsfasen påbörjas, för varje patient, kommer demografiska data att samlas in, tillsammans med information om kaffe- och rökvanor, alkohol, frukt, grönsaker, konsumtion av antiinflammatoriska läkemedel, energi- och näringsintag, som potentiell bias. Alla dessa data kommer att bedömas med hjälp av ett frågeformulär för kvantitetsfrekvens som utformats för användning i denna studie. Vid tidpunkten 0 (T0) kommer patienterna att kategoriseras i två grupper i förhållande till deras rutinmässiga kaffeintag: 0-2 koppar/dag och 3-5 koppar/dag. Denna cut-off valdes för att i de flesta tidningar observeras en effekt av kaffekonsumtion i över 2 koppar/dag.

Försökspersonerna kommer att uppmanas att under hela studien upprätthålla sina mat- och lustvanor, medan användningen av andra koffeinhaltiga drycker är förbjuden.

Försöksdesign av studien

Patienterna kommer att undersökas för alla markörer i början av studien (T0) och sedan randomiseras med hjälp av en datorgenererad lista (StatsDirect statistikprogram) i två grupper, med antingen 4 kaffekoppar/dag intag under 1 månad eller abstinens för samma tidsperiod. Uppenbarligen är blindning inte möjlig och vi beslutade att inte ordinera någon uttvättningsperiod, eftersom T0-provet undersöktes i relation till patienternas rutinmässiga kaffekonsumtion.

Efter 30 dagar kommer patienterna att testas igen, och sedan flyttas över till motsatt "behandling" (in i kaffearmen de som var abstinenta den första månaden och vice versa de som drack kaffe) och kontrolleras igen efter andra gången period.

Varje patient testas därför tre gånger, vid T0, när han/hon går in i studien, efter kaffe och efter abstinens, varvid varje patient har kontroll över sig själv i de två faserna. För enkelhets skull kommer alla data som erhållits efter kaffekonsumtion att jämföras med alla data som erhållits under abstinens, oavsett tidssekvensen för exponering/abstinens.

Med tanke på (på grundval av publicerade data) en förväntad kaffeeffekt hos minst 40 % av de exponerade försökspersonerna, med 1 kontroll för fall, med 5 % alfafel och med 80 % effekt, den urvalsstorlek som krävs (20 fall och 20 kontroller) motsvarade det valda urvalet för studien. Dessutom, i denna studie, med tanke på cross-over-designen där varje patient undersöks två gånger, en gång under kaffeexponering och en gång under abstinens, är det faktiska antalet undersökta patienter 40 per arm, dubbelt så högt därför än vad som krävs.

Patienterna kommer att få ett formulär där de registrerade eventuella avvikelser och efterlevnad med avseende på kaffeintag och lämpliga telefonkontakter för att omedelbart rapportera eventuella biverkningar. För att minska risken för eventuell snedvridning på grund av interindividuella förändringar i tillredningen av kaffe, kommer patienterna att förses med en typisk italiensk kaffemaskin av spishäll (MokaTMBialetti), den erforderliga mängden kaffe för beredning av kaffe. de 4 kaffekopparna/dag (8 g för varje kaffeberedning) och instruktioner om hur man förbereder det.

Kaffemärket är en 100% Coffea arabica produkt från hyllan. Vi vill också analysera produkten vi använder. Analyserna kommer att utföras av ett kontraktslabb (Eurofins analytic GmbH - Hamburg-Tyskland).

Patienterna instrueras att inte dricka något annorlunda tillagat kaffe och var tvungna att i lämplig form rapportera varje avvikelse från studien.

Metoder Blodprover kommer att samlas in och förvaras vid -20°C i högst 3 veckor.

I denna studie kommer följande parametrar att utvärderas:

1. AST/ALT, gammaglutamyl-transpeptidas (γGT) och alkaliskt fosfatas (ALP) nivåer;
2. viral belastning (HCV-RNA-titer),
3. markörer för oxidativ skada: 8-hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG), kväveoxid (NO), Advanced Oxidation Protein Products (AOPP),
4. markör för genomisk stabilitet: Telomere Length (TL),
5. markörer för celldöd: M30 och M30/M65,
6. markörer för leverfibros och angiogenes: Procollagen Type III (PIIINP) och Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).

Bestämning av leverfunktionstest Serumnivåer av ASAT och ALAT, gammaGT och ALP kommer att bestämmas som en del av den rutinmässiga kliniska proceduren.

HCV-RNA-bestämning Närvaron av HCV-RNA i serumet kommer att bedömas genom amplifiering med PCR av den 5'-otranslaterade regionen (5'-UTR) av HCV, den mest konserverade regionen av viruset. Testet utförs på alla försökspersoner som är positiva för anti-HCV-antikroppar (screeningtest). Amplifieringen kommer att utföras i två steg, genom "kapslade PCR".

8-OHdG-bestämning Denna analys kommer att utföras enligt följande: i korthet består denna analys av tre steg: (i) genomisk DNA-extraktion med hjälp av ett Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Italia, Milano); (ii) nukleas Pl och alkaliskt fosfatashydrolys av DNA; (iii) 8-OHdG-bestämning med användning av en HPLC utrustad med en elektrokemisk detektor (HPLC-ED) (ESA Coulochem II 5200 A, Bedford, MA). 8-OHdG-nivåerna uttrycks som antalet 8-OHdG-addukter/105 dG.

NO-bestämning Serum NO-nivåer kommer att analyseras spektrofotometriskt genom att mäta ackumuleringen av dess stabila nedbrytningsprodukter, nitrat och nitrit (Oxford Biomedical Research, USA). NO-nivåer kommer att uttryckas som µmol/L, som en markör för aktivering och nitrosering av kväveoxidsyntas.

AOPP-bestämning AOPP-nivåer i plasma kommer att mätas med en spektrofotometrisk metod utförd av Witko-Sarsat. AOPP-koncentrationer uttrycks som µmol/L kloramin-T-ekvivalenter.

TL-analys med kvantitativ PCR Genomiskt DNA extraherat kommer också att användas för att mäta TL med hjälp av en metod utvecklad av Cawthon. Två 96-brunnars plattor preparerades för varje experiment, en innehållande telomerprimrar och den andra för 36B4, kodande för surt ribosomalt fosfoprotein PO som används som enkelkopiagenen.

Varje 25 µl PCR-reaktion inkluderade 40 ng DNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) och primers i slutkoncentrationerna 270 nM Tel-1 och 900 nM Tel-2 eller 300 nM 36B4u respektive 500 nM 36B4d.

PCR-amplifiering utförs i en ABI PRISM 7900 (Applied Biosystem). I varje platta produceras en standardkurva som sträcker sig från 4 till 80 ng humant referens-DNA (Applied Biosystem). Den termiska cyklingsprofilen för telomerförstärkningen är 95°C i 10 minuter, följt av 30 cykler av 95°C i 5 s, 56°C i 10 s och 72°C i 60 s eller 30 cykler av 95°C i 5 s, 58°C i 10 s och 72°C i 40 s. Efter amplifiering utförs en dissociationskurva för att bekräfta reaktionens specificitet. Alla prover analyseras i tre exemplar för att testa analysens reproducerbarhet och i varje analys utvärderas en negativ kontroll.

Fluorescenssignaler och dissociationskurvor analyseras med programvaran ABI 7900 SDS 2.3.

Bestämning av celldöd M30-Apoptosense ELISA (Peviva, USA) är en ettstegs in vitro-immunanalys för kvantitativ bestämning av den apoptosassocierade CK18Asp396 (M30) neo-epitopen i plasma. Koncentrationen av antigenet som kvantifierar pågående apoptotisk celldöd, uttrycks som U/L.

M30-Apoptosense ELISA används i kombination med M65 ELISA (Peviva, USA), för kvantitativ bestämning av totalt lösligt CK18 frisatt från döda celler (nekrotisk och apoptotisk). Koncentrationen av antigenet uttrycks som U/L.

PIIINP- och VEGF-bestämning Plasma-PIIINP-nivåer kommer att bestämmas med hjälp av ELISA-kit (USCN, Kina). PIIINP-nivåer uttrycks som ng/ml som en markör för vävnadskollagenavlagring och fibros. Serum VEGF kommer att bestämmas som en markör för neo-angiogenes och vävnadsombildning med hjälp av ett ELISA-kit (Bender MedSystems, Österrike), data uttrycks i ng/L.

Statistiska data kommer att analyseras med envägs ANOVA, parat t-test, Students t-test för oparade data, linjär regression (SPSS, STATSDIRECT) med statistisk signifikans satt till p <0,05 (2-tailed). All jämförelse avseende kaffeexponering och abstinens kommer att utföras inom patienter och inte inom grupper, med användning av, som sagt, en pardata-metod.