阿尔茨海默病的生物标志物研究 (BiomarkerAD)

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是大脑认知功能丧失和功能衰退。 这种情况的病理特征之一是淀粉样蛋白 β 肽 (A-beta) (1) 在大脑中的逐渐沉积。 一旦沉积在大脑中，肽就会通过引发慢性炎症发挥毒性作用，这种炎症最初会干扰正常的大脑功能并最终导致神经元死亡 (2)。 目前假设，在 A-β 积累达到一定阈值时，大脑中的补偿机制不再足以应对 A-β 毒性，AD 的临床综合征就会发展。 在临床症状变得明显之前，A-β 可能会在长达 10-15 年的时间内在大脑中积累。 有人提出了 A-beta 的积累是否可能是正常衰老过程的问题，这表明所有人如果活得足够长都可能易患这种疾病——值得注意的是，阿尔茨海默氏病的患病率上升到 40% 以上85岁以上。

在参与 AD 发展的许多可能与衰老相关的因素中，免疫系统的衰老可能会显着增强大脑的变化并加剧患有这种疾病的患者的神经功能衰退。 免疫衰老的直接后果是全身感染的频率增加，事实上，许多死于 AD 的人以前曾遭受过严重感染。 由于 AD 患者在大脑中有持续的慢性炎症反应，与神经胶质细胞的激活和部分破坏的血脑屏障有关，全身性炎症可能会加剧大脑中的这一过程并增加整体神经元损伤。

与免疫激活造成的损害相反，A-beta 疫苗接种研究在该疾病的小鼠模型中显示出非常有前途的效果，特别是在 A-beta 抗体清除淀粉样斑块方面 (3)。 在 AD 患者中进行测试时，6% 的接种疫苗患者的大脑出现了严重的炎症反应 (4)。 尽管如此，一组患者在诱导特定抗体的情况下表现出改善的认知测试 (5)。 在最近的一项研究中，我们证明这种脑部炎症可能是由于大脑中 IFN-γ 水平升高 (6)，这可能是亚临床全身感染和在人类中观察到的特异性免疫反应的结果。

当慢性炎症在整个疾病过程中进展时，免疫系统的特定部分，即脑特异性淋巴细胞，也可能受到刺激发挥作用。 与之前的假设相反，我们在患有 AD 的人类受试者中的发现表明，与中年个体相比，在老年个体和 AD 患者中确实显着诱导了对 A-β 的特异性免疫反应 (7)。 这种对 A-β 的免疫反应在人体中的性质和作用尚待研究，并可能导致与神经元细胞死亡相关的途径的表征，并导致新的诊断方式和免疫治疗方法。

本研究的目的是确定可能与 A-β 诱导的大脑炎症相关的外周标志物在临床 AD 患者中是否增加。

方法 这是一项观察性初步研究，将 AD 患者外周血中的炎症标志物水平与年龄匹配且认知正常的老年人以及健康的年轻对照者进行比较。

受试者将包括根据 DSM-IV 标准诊断为患有临床 AD 的 60 岁以上的男性和女性。 对照组将包括 60 岁以上认知正常的居住在社区的男性和女性。 另外，一组20-30岁的健康青年男女对照作为参照组。 老年患者和对照组的诊断将由贝尔舍瓦心理健康中心记忆诊所的多学科专家小组独立确定。

将要求所有受试者和对照提供参与研究的书面知情同意书。 对于 AD 患者，需要独立的精神科医生确认患者有能力同意参与研究。 对于判断力受损且无法同意其参与的 AD 患者，将需要法定监护人提供书面知情同意书。

在获取人口统计数据后，将从所有受试者中抽取单份 25 毫升血液。 将血液抽入两支 10 ml 的肝素化试管中，并抽取一支 5 ml 的血清学试管（含促凝血剂）用于血清分离。 肝素化管将保持在室温下，直到淋巴细胞在同一天被纯化。 血清样本将储存在 4°C。 将在中午之前抽血，以方便当天进行净化。 在外周血单核细胞 (PBMC) 和血清分离后，将进行以下分析：

1. AD特异性单克隆抗体的产生。 由于结合 A-β 的 N 末端部分的抗体增强了它从大脑中的清除，并且现在正在临床试验中进行测试，因此鉴定在 AD 患者中诱导的自然产生的特异性单克隆抗体并确定它们是否影响病程。 这种特异性抗体也可能具有诊断和治疗特性。 这些特定的人类单克隆抗体将通过杂交瘤技术使用称为 MFP-2 的专有融合伙伴细胞系在体外分离和生产。 简而言之，PBMCs 将与 MFP-2 融合，所得杂交瘤将针对非特异性 Ig 的产生进行筛选，然后使用标准的 ELISA 技术筛选那些对 A-β 具有特异性的免疫球蛋白。 分泌特定人类单克隆抗体的杂交瘤将被连续亚克隆以稳定、扩增并在确定的培养基中生长以产生大量单克隆抗体。
2. T 细胞亚群和血清衍生细胞因子的分析。 衰老与免疫系统的衰老有关，表现为幼稚 T 细胞的减少以及记忆和调节性 T 细胞的增加。 结果，外周和大脑中的细胞因子稳态发生改变，可能有助于 AD 的发病机制。 因此，将使用荧光激活细胞分选 (FACS) 和 ELISA 血清衍生细胞因子对 T 细胞亚群（初始和记忆 CD4、CD8 和调节性 CD4CD25）进行分析，并将其与患者的临床评分相关联。

将使用 Student's-t 检验对组间平均值差异进行统计评估。