Estudio de biomarcadores para la enfermedad de Alzheimer (BiomarkerAD)

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva caracterizada por la pérdida de las funciones cerebrales cognitivas y el deterioro funcional. Una de las características patológicas de esta condición es la deposición progresiva en el cerebro del péptido beta amiloide (A-beta) (1). Una vez depositado en el cerebro, el péptido ejerce un efecto tóxico al desencadenar una inflamación crónica que interfiere inicialmente con el funcionamiento normal del cerebro y finalmente provoca la muerte neuronal (2). Actualmente se postula que en un cierto umbral de acumulación de A-beta, los mecanismos compensatorios en el cerebro ya no son suficientes para hacer frente a la toxicidad de A-beta, y se desarrolla el síndrome clínico de EA. Es posible que A-beta se acumule en el cerebro durante un período de hasta 10 a 15 años antes de que los síntomas clínicos se vuelvan significativos. Se ha planteado la cuestión de si la acumulación de A-beta es posiblemente un proceso normal de envejecimiento, lo que sugiere que todas las personas pueden ser susceptibles a la enfermedad si viven lo suficiente; es de destacar que la prevalencia de la enfermedad de Alzheimer aumenta a más del 40 %. mayores de 85 años.

Entre los muchos posibles factores relacionados con el envejecimiento que intervienen en el desarrollo de la EA, la senescencia del sistema inmunitario puede potenciar significativamente los cambios en el cerebro e intensificar el deterioro neurológico en los pacientes con esta enfermedad. Una consecuencia directa de la inmunosenescencia es el aumento de la frecuencia de infecciones sistémicas y, de hecho, muchos de los que fallecen con EA han sufrido previamente una infección grave. Dado que los pacientes con EA tienen una respuesta inflamatoria crónica en curso en el cerebro, asociada con la activación de las células gliales y una barrera hematoencefálica parcialmente alterada, la inflamación sistémica puede intensificar este proceso en el cerebro y aumentar el daño neuronal general.

En contraste con el daño causado por la activación inmune, los estudios de vacunación A-beta han mostrado efectos muy prometedores en modelos de ratón de la enfermedad, particularmente con respecto a la eliminación de las placas amiloides por parte de los anticuerpos A-beta (3). Cuando se probó en pacientes con EA, el 6 % de los pacientes vacunados desarrollaron reacciones inflamatorias graves en el cerebro (4). No obstante, una cohorte de pacientes mostró mejores pruebas cognitivas en las que se indujeron anticuerpos específicos (5). En un estudio reciente, demostramos que dicha inflamación cerebral puede deberse a niveles elevados de IFN-γ en el cerebro (6), posiblemente como resultado de una infección sistémica subclínica y las respuestas inmunitarias específicas observadas en humanos.

Mientras que la inflamación crónica progresa a lo largo de la enfermedad, el brazo específico del sistema inmunitario, es decir, los linfocitos específicos del cerebro, también pueden verse estimulados para desempeñar un papel. En contraste con las suposiciones anteriores, nuestros hallazgos en sujetos humanos con EA demuestran que una respuesta inmune específica a A-beta se induce significativamente tanto en personas mayores como en pacientes con EA en comparación con personas de mediana edad (7). La naturaleza y el papel de esta respuesta inmune a A-beta en el hombre aún no se han investigado y pueden conducir a la caracterización de vías asociadas con la muerte de células neuronales y dar lugar a nuevas modalidades de diagnóstico y enfoques inmunoterapéuticos.

El propósito de este estudio es determinar si los marcadores periféricos posiblemente relacionados con la inflamación del cerebro inducida por A-beta aumentan en pacientes con DA clínica.

Método Este es un estudio piloto observacional que compara el nivel de marcadores inflamatorios en la sangre periférica de pacientes con DA con el de ancianos de la misma edad y cognitivamente normales, así como con controles jóvenes sanos.

Los sujetos incluirán hombres y mujeres mayores de 60 años diagnosticados de AD clínica de acuerdo con los criterios del DSM-IV. El grupo de control estará compuesto por hombres y mujeres mayores de 60 años cognitivamente normales que viven en la comunidad. Además, un grupo de controles masculinos y femeninos jóvenes sanos de 20 a 30 años de edad servirá como grupo de referencia. El diagnóstico tanto de los pacientes mayores como de los controles será determinado de forma independiente por un equipo multidisciplinario de expertos en la Clínica de la Memoria del Centro de Salud Mental de Beersheva.

Todos los sujetos y controles deberán proporcionar un consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. En el caso de los pacientes con EA se requerirá que un psiquiatra independiente confirme que el paciente es capaz de aceptar participar en el estudio. En el caso de pacientes con EA que tengan deterioro del juicio y no puedan dar su consentimiento para su participación, se requerirá que un tutor legal proporcione el consentimiento informado por escrito.

Tras la adquisición de datos demográficos, se extraerá una sola cantidad de 25 ml de sangre de todos los sujetos. Se extraerá sangre en dos tubos heparinizados de 10 ml cada uno y se extraerá un tubo serológico (con procoagulante) de cinco ml para el aislamiento del suero. Los tubos heparinizados se mantendrán a temperatura ambiente hasta que se purifiquen los linfocitos el mismo día. Las muestras de suero se almacenarán a 4 °C. Se extraerá sangre antes del mediodía para facilitar la purificación en el mismo día. Después del aislamiento de sueros y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se realizará el siguiente análisis:

1. Generación de anticuerpos monoclonales específicos de AD. Dado que los anticuerpos que se unen a la porción N-terminal de A-beta mejoran su eliminación del cerebro y ahora se prueban en un ensayo clínico, es importante identificar los anticuerpos monoclonales específicos de origen natural inducidos en pacientes con DA y determinar si afectan el curso de la enfermedad. Dichos anticuerpos específicos también pueden tener propiedades diagnósticas y terapéuticas. Estos anticuerpos monoclonales humanos específicos se aislarán y producirán in vitro mediante la técnica de hibridoma utilizando una línea celular asociada de fusión patentada conocida como MFP-2. Brevemente, las PBMC se fusionarán con MFP-2 y los hibridomas resultantes se examinarán para la producción de Ig no específica y luego para aquellas inmunoglobulinas que son específicas de A-beta usando técnicas estándar de ELISA. Los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos específicos se subclonarán en serie para su estabilización, se expandirán y crecerán en medios definidos para la producción de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales.
2. Análisis de subconjuntos de células T y citocinas derivadas de suero. El envejecimiento está asociado con la senecense del sistema inmunitario expresada por una disminución de las células T vírgenes y un aumento de las células T de memoria y reguladoras. Como resultado, la homeostasis de las citocinas tanto en la periferia como en el cerebro se altera y puede contribuir a la patogenia de la EA. Por lo tanto, se realizarán análisis de subconjuntos de células T (CD4, CD8 y CD4 CD25 reguladores y vírgenes y de memoria) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y citoquinas derivadas de suero mediante ELISA y se correlacionarán con la puntuación clínica de los pacientes.

La evaluación estadística de las diferencias en los valores medios entre los grupos se realizará mediante la prueba t de Student.