智利胃癌工作组 (FORCE 1) (FORCE-1)

参与实体：智利胃癌特别工作组 (GCTF) 是两个主要机构之间的集体努力：1- 精准医学卓越中心 (CEMP)，由政府经济发展机构 (Corporacion) 联合资助建立de Fomento de la Produccion, CORFO) 和 Pfizer Chile 以及 2- 位于智利 Pontificia Universidad Católica 的 UC 肿瘤学研究中心 (CITO)。 这两个实体都是非营利性研究组织，旨在加强公众教育和实施战略，以改善肿瘤治疗和癌症预防的临床结果。

主要目标：将智利 GC 患者分为预后亚组，并根据 200 名 GAC 患者队列中的临床、蛋白质、表观遗传和基因改变来关联治疗反应。

次要目标

• 确定智利 GC 患者的突变谱。
• 评估可以从当前可用的药物靶标（可操作基因）中受益的智利 GC 患者的百分比。
• 将 EBV 的存在与临床参数相关联。
• 评估与分子分层和目前靶向治疗相关的蛋白质表达水平（例如 PD-L1 和抗血管生成药）
• 确定智利 GC 患者 DPYD 和 TYMS 基因中 SNP 的概况及其与不良事件的相关性。

学习规划

伦理批准 GCTF 是一项非干预性、协作性、前瞻性非同步研究，旨在根据患者的预后和治疗反应对 GAC 患者进行分层。 该研究将严格遵守国际机构制定的管理人体生物医学研究伦理行为的所有法律要求、法规和一般原则，遵循良好临床实践和赫尔辛基宣言。 GCTF 研究方案已获得大学医院伦理委员会的批准（Pontificia Universidad Catolica de Chile，CEC MED UC 批准号 16-046，决议日期为 2016 年 4 月 21 日）。

患者招募和特征诊断为 GC 的患者将从智利圣地亚哥的 Red UC Christus 网络招募。 患者招募和签署知情同意书、患者医疗记录、生物材料和样本提取的维护和监测将由 CITO 管理。

患者和治疗史显示，除了手术和化疗外，大约 10% 的患者接受了曲妥珠单抗（ERBB2 靶向治疗，也称为赫赛汀），另外 10% 接受了免疫治疗，包括 pembrolizumab 和 Ipilimumab（检查点抑制剂）。 最后大约 5% 的患者接受了抗血管生成治疗（包括 VEGFR2 靶向治疗和 Ramucirumab）。 此外，组织学分析显示，大约 50% 的患者被归类为肠型，30% 为弥漫型，20% 为混合型或不确定型。

纳入标准

• 成年男性或女性，年龄 >18 岁
• 被诊断患有胃癌（组织学或细胞学）
• 在 Red UC Christus 网络的健康中心就诊至少 3 个月并进行临床随访
• 能够阅读和说西班牙语
• 愿意并能够提供对研究的书面知情同意书，该同意书应在注册时注明日期并签字。

排除标准

患者：

• 小的活检样本不足以进行分析。
• 谁的病历无法收集或无法获得。
• 未经签署知情同意书。

临床数据 患者的临床数据将由医疗保健提供者获取并输入在线电子平台。 样本将被编码，患者身份只有主治医师知道。 临床变量分为以下部分：一般患者信息、癌症病史、实验室研究、合并症 (Charlson) 指数、化疗、疗效和随访以及毒性。 患者化疗将按以下方式分类：治疗方案、周期数和治疗时间以及前 6 个月的化疗剂量强度。 化疗方案代表开给患者的一线化疗。 前 6 个月的完整化疗剂量强度将通过患者访谈获得，并直接输入在线平台。 最后，从患者那里获得疗效、随访和毒性数据。

主要临床结果 主要结果将从获得的临床数据中推断出来，包括总生存率、无进展生存率和无复发生存率。

生物样本和 Oncomine 综合分析 在 Red UC Christus 获得的生物材料将根据标准化协议运送到智利圣地亚哥的 CEMP。 将从存档的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本中获取总共 200 个患者肿瘤样本。 将使用 RecoverAll 试剂盒 (Thermo Fisher Cat #AM1975) 提取核酸，并使用市售的 Oncomine Comprehensive Assay 试剂盒进行分析。 该测定同时分析样本中的 DNA 和 RNA，允许评估 73 个基因热点（基于 DNA）、49 个焦点拷贝数变异（CNV，基于 DNA）、26 个完整编码序列（用于突变和 CNV 丢失）和 22 个基因融合驱动程序（核糖核酸）。 值得注意的是，其中 72 个基因是药物靶标。 获得的基因组原始数据（.vcf 和 .pdf 文件）将被存储和备份在本地数据中心，用于后续的基因组分析。 在本研究结果公布后，Oncomine 结果以及单个肿瘤的临床分类将公开发布。

组织微阵列 (TMA) 分析 以下基因将通过 TMA 使用特异性抗体进一步分析：PD-L1（Dako，目录号 SK00521）、PD-L2（Thermo 目录号 B7-DC/CD273）、磷酸化 mTOR（ Abcam 目录号 AB118815）、p53（目录号 5278074001）、VEGFR2（Abcam 目录号 AB39256）、磷酸化 Akt（Thermo 目录号 473）、HER2（罗氏，目录号 05278368001）、p16（罗氏，目录号 06695221001）、Met（ Abcam Cat #AB51067)、HA-4 (Abcam Cat #AB24480) 和四个微卫星标记（均来自 Roche）：MLH1（Cat # 06472966001）、MSH2（Cat # 05269270001）、MSH6（Cat # 5929911001）、PMS2（Cat # 06419216001）。 手动 TMA 将如前所述准备。 简而言之，将获得石蜡块并用苏木精和曙红（H＆E）切割和染色以选择最佳组织学区域。 随后选定的组织区域将通过在相应块中圈出已识别的区域来放置到 TMA 中。 使用 1 mm 探针从每个石蜡块中提取圆柱形核心活组织检查，并将其放入新的受体块中。 选择足够的病例，肿瘤至少占据核心区域的 10%。 每个病例将一式三份处理，以防止切割过程中组织损失。 每个组织阵列块的切片将被切割、脱石蜡和脱水，用于 H&E 和免疫组织化学程序。

基因甲基化 将评估六个选定基因的启动子基因甲基化，这些基因之前显示启动子通过与 GC 相关的甲基化进行调节。 甲基化分析将包括 reprimo 基因和其他与 GC 进展相关的 mRNA。 分析将通过亚硫酸氢盐测序进行，如前所述，使用 EZ DNA 甲基化金试剂盒（Zymo Research）稍作修改。 简而言之，使用特定的 PCR 引物扩增亚硫酸氢盐处理的 DNA，随后对 PCR 产物进行克隆和测序。

EBV 鉴定 患者样本中的 EBV 亚型将使用显色原位杂交 (CISH) 方法并稍加修改进行评估。

单核苷酸多态性 (SNP) 分析 很大一部分 GC 患者会因 5-FU 治疗而出现严重毒性，包括骨髓抑制、神经病变、白细胞数量低、发烧、感染、恶心、呕吐、严重腹泻、口腔和消化道炎症，所有这些都记录在其他队列的患者病史中。 DNA 中细微的个人和人群变化，称为 SNP，可以解释 5-FU 毒性风险的增加； 5-FU 代谢主要在肝脏中进行，其中 DPYD 酶负责代谢 >80% 的药物，产生无活性代谢物 5,6 二羟基-5-FU。 据广泛记载，DPYP 活性降低与严重毒性有关。 5-FU 的非代谢部分 (20%) 被一系列酶（例如 TP、TK）转化，产生会引起 TYMS 抑制的活性代谢物，从而促进 DNA/RNA 损伤。 TYMS 和 MTHFR 基因的变异（与叶酸合成减少、5-FU 效应增加有关）与 5-FU 治疗的毒性有关。 用于选择遗传变异的方法包括在数据库 PharmGKB 中进行搜索。 将分析总共六个非同义 SNP：其中四个包含 DPYD 基因，一个用于 TYMS，一个用于 MTHFR。 将使用 TaqMan™ SNP 基因分型分析技术 (Applied Biosystems™) 进行分析。 将在从石蜡包埋的患者样本中分离的 DNA 中评估 SNP。

样本量和统计分析

将计算最小样本数，以确保项目的目标完全实现。 考虑到大约 90% 的 GC 病例确实是 GAC，在 5% 的错误率和 95% 的置信区间下，研究人员最初预计样本量为 200 名患者。 然而，研究人员还考虑了 15% 的样本丢失率（有缺陷的样本或患者退出），这使得总共招募了 230 名患者。

标准描述性统计将用于分析定性和定量变量，例如相对和绝对频率、频率表、平均值、中位数、标准偏差、范围和四分位数。 95% 的置信度将被认为适合进行分析。 描述性统计也将用于表征最相关的临床测量参数。 分类变量的关联将通过卡方检验或 Fisher 精确检验来执行。 单臂方差分析将比较组间的连续变量。 生存结果研究将使用 Kaplan-Meier 方法完成。 预后因素将根据 Cox 比例风险回归模型进行评估。

将对基因变异进行主成分分析 (PCA)，并将评估第一主成分与一组小型预定义基因组改变特征的关联。 为了定义分子亚群，研究人员将利用无监督聚类。 分子亚型与临床数据的相关性（例如 年龄、性别、Lauren 等级）和临床结果（例如 将评估总生存期、反应率）。 此外，将根据临床结果进行监督分类，并将两种方法的结果组与其他报告的分子亚型进行比较。

患者保护/书面知情同意书

各方保证保护患者的个人记录。 除法律要求的文件外，患者姓名不以任何形式包含在表格报告、出版物或源自研究的任何类型的可发布文件中。 知情同意书是严格按照法律和地方法规制定的。 书面知情同意书，包括在整个研究过程中所做的所有更改，必须在纳入研究之前得到内部审查委员会/独立伦理委员会和 CEMP 的前瞻性批准。

在进行任何特定的研究活动之前，研究人员、代表或医疗保健提供者将从每位患者或法定代表处获得书面知情同意书。