Força-Tarefa de Câncer Gástrico do Chile (FORCE 1) (FORCE-1)

Entidades participantes: A Força-Tarefa do Câncer Gástrico do Chile (GCTF) é um esforço coletivo entre duas identidades principais: 1- O Centro de Excelência em Medicina de Precisão (CEMP), que foi estabelecido por meio de um financiamento conjunto da agência governamental de desenvolvimento econômico (Corporacion de Fomento de la Produccion, CORFO) e Pfizer Chile e 2- O Centro UC de Investigação em Oncologia (CITO) com sede na Pontificia Universidad Católica de Chile. Ambas as entidades são organizações de pesquisa sem fins lucrativos destinadas a melhorar a educação pública e implementar estratégias para melhorar os resultados clínicos no tratamento oncológico e na prevenção do câncer.

Objetivo primário: Estratificar os pacientes chilenos com GC em subgrupos prognósticos e correlacionar a resposta terapêutica de acordo com alterações clínicas, proteicas, epigenéticas e genéticas em uma coorte de 200 pacientes com GAC.

Objetivos secundários

• Determinar o perfil de mutação em pacientes chilenos com GC.
• Avaliar a porcentagem de pacientes chilenos com GC que poderiam se beneficiar dos alvos drogáveis ​​atualmente disponíveis (genes acionáveis).
• Correlacionar a presença de EBV com parâmetros clínicos.
• Para avaliar os níveis de expressão de proteínas associadas a estratificações moleculares e terapias atualmente direcionadas (ex. PD-L1 e antiangiogênicos)
• Determinar o perfil de SNPs nos genes DPYD e TYMS em pacientes chilenos com GC e sua correlação com eventos adversos.

Design de estudo

Aprovação ética O GCTF é um estudo não intervencional, colaborativo, prospectivo não concorrente que busca estratificar os pacientes do GAC com base em seu prognóstico e resposta à terapia. O estudo seguirá estritamente todos os requisitos legais, regulamentos e princípios gerais estabelecidos por agências internacionais que regem a conduta ética em pesquisa biomédica em seres humanos, seguindo as boas práticas clínicas e a declaração de Helsinque. O protocolo do estudo GCTF foi aprovado pelo Comitê de Ética do hospital universitário (Pontificia Universidad Catolica de Chile, número de aprovação CEC MED UC 16-046, resolução de 21 de abril de 2016).

Recrutamento e características dos pacientes Os pacientes diagnosticados com CG serão recrutados da rede Red UC Christus em Santiago, Chile. O recrutamento de pacientes e assinatura de formulários de consentimento informado, manutenção e monitoramento de registros médicos de pacientes, material biológico e extrações de amostras serão gerenciados pelo CITO.

O histórico do paciente e do tratamento revela que, além da cirurgia e quimioterapia, aproximadamente 10% dos pacientes receberam Trastuzumab (terapia direcionada a ERBB2, também chamada de Herceptin), outros 10% receberam imunoterapia, incluindo pembrolizumab e Ipilimumab (inibidores de checkpoint). Finalmente, aproximadamente 5% dos pacientes receberam terapia antiangiogênica (consistindo em terapia direcionada ao VEGFR2 com Ramucirumab). Além disso, a análise histológica mostrou que aproximadamente 50% dos pacientes foram classificados como tipo intestinal, 30% como difuso e 20% como misto ou indeterminado.

Critério de inclusão

• Adulto masculino ou feminino, com idade > 18 anos
• Diagnosticado com câncer gástrico (histológico ou citológico)
• Frequentar os centros de saúde da Rede UC Christus há pelo menos 3 meses com acompanhamento clínico
• Capaz de ler e falar espanhol
• Disposto e capaz de fornecer consentimento informado por escrito para o estudo, que deve ser datado e assinado no momento da inscrição.

Critério de exclusão

Pacientes:

• Com pequenas amostras de biópsia insuficientes para análise.
• Cujos registros médicos não podem ser coletados ou estão indisponíveis.
• Sem consentimento informado assinado.

Dados clínicos Os dados clínicos dos pacientes serão obtidos pelos profissionais de saúde e inseridos em uma plataforma eletrônica online. As amostras serão codificadas e a identidade do paciente conhecida apenas pelo médico assistente. As variáveis ​​clínicas são divididas em seções: Informações Gerais do Paciente, Histórico de Câncer, Estudos Laboratoriais, Índice de Comorbidade (Charlson), Quimioterapia, Eficácia e Acompanhamento e Toxicidade. A quimioterapia do paciente será classificada por: regime, número de ciclos e tempo de tratamento e intensidade da dose de quimioterapia durante os primeiros 6 meses. Esquemas quimioterápicos que representam a quimioterapia de primeira linha prescrita aos pacientes. A intensidade total da dose de quimioterapia durante os primeiros 6 meses será obtida por meio de entrevistas com o paciente e inseridas diretamente na plataforma online. Finalmente, eficácia e acompanhamento e dados de toxicidade obtidos dos pacientes.

Desfechos clínicos principais Os resultados principais serão inferidos a partir dos dados clínicos obtidos, incluindo sobrevida global, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de recorrência.

Amostras biológicas e Ensaio Integral Oncomine Os materiais biológicos obtidos na Red UC Christus serão transportados para o CEMP em Santiago do Chile sob protocolos padronizados. Um total de 200 amostras de tumores de pacientes será obtido a partir de amostras arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). Os ácidos nucleicos serão extraídos usando o kit RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) e analisados ​​usando o kit Oncomine Comprehensive Assay disponível comercialmente. Este ensaio analisa simultaneamente DNA e RNA de amostras, permitindo a avaliação de 73 hotspots gênicos (baseados em DNA), 49 variações de número de cópias focais (CNVs, baseadas em DNA), 26 sequências de codificação completas (para mutações e perda de CNV) e 22 fusões gênicas motoristas (ARN). Notavelmente, 72 desses genes são alvos de drogas. Dados brutos genômicos obtidos (.vcf e .pdf arquivos) serão armazenados e copiados em um Data Center local para posterior análise genômica. Após a publicação dos resultados deste estudo, os resultados do Oncomine juntamente com a classificação clínica de tumores individuais serão disponibilizados publicamente.

Análise de Tissue Micro Array (TMA) Os seguintes genes serão posteriormente analisados ​​por um TMA usando anticorpos específicos contra: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat # B7-DC/CD273), Fosforilado mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat #AB39256), Phosphorylated Akt (Thermo Cat #473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 06695221001), Met ( Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) e quatro marcadores microssatélites (todos da Roche): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5929911001), PMS2 (Cat # 06419216001). O TMA manual será preparado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, blocos de parafina serão obtidos e cortados e corados por Hematoxilina & Eosina (H&E) para selecionar a melhor área histológica. A área de tecido subsequentemente selecionada será colocada no TMA circulando a área identificada no bloco correspondente. Biópsias cilíndricas serão extraídas de cada bloco de parafina usando um estilete de 1 mm e colocadas em um novo bloco receptor. Casos adequados selecionados tinham tumores que ocupavam pelo menos 10% da área central. Cada caso será processado em triplicado para evitar a perda de tecido durante o corte. Seções de cada bloco de matriz de tecido serão cortadas, desparafinadas e desidratadas para procedimentos de H&E e imuno-histoquímica.

Metilação do gene A metilação do gene promotor em seis genes selecionados que já mostraram regulação do promotor por metilação associada a GC será avaliada. A análise de metilação incluirá o gene reprimo e outros mRNAs associados à progressão do GC. A análise será realizada por sequenciamento de bissulfito conforme descrito anteriormente usando o kit EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) com pequenas modificações. Resumidamente, o DNA tratado com bissulfito é amplificado usando iniciadores de PCR específicos, com os produtos de PCR subsequentemente clonados e sequenciados.

Identificação de EBV Os subtipos de EBV em amostras de pacientes serão avaliados usando o método de hibridação cromogênica in situ (CISH) com pequenas modificações.

Análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Uma proporção significativa de pacientes com GC pode desenvolver toxicidade grave do tratamento com 5-FU, incluindo supressão da medula óssea, neuropatia, baixo número de glóbulos brancos, febre, infecções, náuseas, vômitos, diarreia grave, boca e trato digestivo inflamação, todas registradas no histórico de pacientes de outras coortes. Mudanças sutis pessoais e populacionais no DNA, chamadas SNPs, podem ser responsáveis ​​por aumentos no risco de toxicidade do 5-FU; O metabolismo do 5-FU é predominantemente hepático, onde a enzima DPYD é responsável por metabolizar >80% da droga, produzindo o metabólito inativo 5,6 diidroxi-5-FU. Está amplamente documentado que uma atividade diminuída do DPYP está associada a toxicidade grave. A fração não metabolizada de 5-FU (20%) é transformada por uma série de enzimas (por exemplo, TP, TK), produzindo os metabólitos ativos que causarão a inibição de TYMS, promovendo danos ao DNA/RNA. Variações nos genes TYMS e MTHFR (relacionadas à redução da síntese de folato, aumento do efeito do 5-FU) foram associadas à toxicidade pelo tratamento com 5-FU. A abordagem utilizada para selecionar as variantes genéticas consistiu em uma busca no banco de dados, PharmGKB. Um total de seis SNPs não sinônimos serão analisados: quatro deles compreendem o gene DPYD, um para TYMS e um para MTHFR. A análise será realizada usando a tecnologia TaqMan™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems™). Os SNPs serão avaliados em DNA isolado de amostras de pacientes embebidas em parafina.

Tamanho da amostra e análise estatística

O número mínimo de amostras será calculado para garantir que os objetivos do projeto sejam totalmente alcançados. Considerando que aproximadamente 90% dos casos de GC são de fato GAC, com taxa de erro de 5% e intervalo de confiança de 95%, os investigadores projetaram originalmente um tamanho de amostra de 200 pacientes. No entanto, os investigadores também consideraram uma taxa de 15% de perda de amostra (amostras defeituosas ou abandono do paciente), o que deu um total de 230 pacientes a serem recrutados.

A estatística descritiva padrão será utilizada para analisar variáveis ​​qualitativas e quantitativas, como frequências relativas e absolutas, tabelas de frequências, média, mediana, desvio padrão, amplitude e quartis. Uma confiança de 95% será considerada apropriada para análise. Estatísticas descritivas também serão usadas para caracterizar os parâmetros clínicos mais relevantes medidos. A associação das variáveis ​​categorizadas será realizada pelos testes qui-quadrado ou exato de Fisher. A Análise de Variância de um braço irá comparar variáveis ​​contínuas entre grupos. Estudos de resultados de sobrevida serão realizados usando o método Kaplan-Meier. Fatores prognósticos serão avaliados de acordo com o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox.

Será realizada análise de componentes principais (PCA) das variantes dos genes e será avaliada a associação dos primeiros componentes principais com um pequeno conjunto pré-definido de assinaturas de alterações genômicas. Para definir subgrupos moleculares, os investigadores utilizarão agrupamento não supervisionado. A correlação dos subtipos moleculares com dados clínicos (por exemplo, idade, sexo, classe de Lauren) e resultados clínicos (por exemplo, sobrevida global, taxa de resposta) serão avaliados. Além disso, a classificação supervisionada será realizada com base nos resultados clínicos e os grupos resultantes de ambas as abordagens serão comparados com outros subtipos moleculares relatados.

Proteção do paciente/formulários de consentimento informado por escrito

Todas as partes garantem a proteção dos registros pessoais dos pacientes. Os nomes dos pacientes não são incluídos de nenhuma forma em relatórios, publicações ou em qualquer tipo de documento publicável derivado do estudo, com exceção dos documentos exigidos por lei. Os formulários de consentimento informado são elaborados seguindo rigorosamente as normas legais e locais. Os formulários de consentimento informado por escrito, incluindo todas as alterações feitas ao longo do estudo, devem ser aprovados prospectivamente pelo Conselho de Revisão Interna/Comitê de Ética independente e pelo CEMP antes de serem incorporados ao estudo.

Os investigadores, representantes ou profissionais de saúde obterão formulários de consentimento informado por escrito de cada paciente ou representante legal antes de qualquer atividade específica do estudo ser realizada.