Chilijska Grupa Zadaniowa ds. Raka Żołądka (FORCE 1) (FORCE-1)

Podmioty uczestniczące: Chilijska Grupa Zadaniowa ds. Raka Żołądka (GCTF) jest zbiorowym wysiłkiem dwóch głównych tożsamości: 1- Centrum Doskonałości Medycyny Precyzyjnej (CEMP), które zostało utworzone dzięki wspólnemu finansowaniu przez rządową agencję rozwoju gospodarczego (Corporacion de Fomento de la Produccion, CORFO) i Pfizer Chile oraz 2- The Centre UC for Investigation in Oncology (CITO) z siedzibą na Pontificia Universidad Católica de Chile. Oba podmioty są organizacjami badawczymi typu non-profit, których celem jest doskonalenie edukacji społeczeństwa i wdrażanie strategii poprawy wyników klinicznych w leczeniu onkologicznym i profilaktyce nowotworów.

Główny cel: stratyfikacja chilijskich pacjentów z GC na podgrupy prognostyczne i skorelowanie odpowiedzi na leczenie zgodnie ze zmianami klinicznymi, białkowymi, epigenetycznymi i genetycznymi w kohorcie 200 pacjentów z GAC.

Cele drugorzędne

• Aby określić profil mutacji u chilijskich pacjentów z GC.
• Aby ocenić odsetek chilijskich pacjentów z GC, którzy mogliby odnieść korzyści z obecnie dostępnych celów leków (geny umożliwiające działanie).
• Aby skorelować obecność EBV z parametrami klinicznymi.
• Aby ocenić poziomy ekspresji białek związanych z stratyfikacjami molekularnymi i obecnie ukierunkowanymi terapiami (np. PD-L1 i antyangiogeniki)
• Określenie profilu SNP w genach DPYD i TYMS u chilijskich pacjentów z GC i ich korelacji ze zdarzeniami niepożądanymi.

Projekt badania

Zgoda etyczna GCTF to nieinterwencyjne, oparte na współpracy, prospektywne, niejednoczesne badanie, którego celem jest stratyfikacja pacjentów z GAC na podstawie ich rokowania i odpowiedzi na leczenie. Badanie będzie ściśle zgodne ze wszystkimi wymogami prawnymi, regulacjami i ogólnymi zasadami ustanowionymi przez międzynarodowe agencje regulujące etyczne postępowanie w badaniach biomedycznych na ludziach, zgodnie z dobrymi praktykami klinicznymi i deklaracją helsińską. Protokół badania GCTF został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego (Pontificia Universidad Catolica de Chile, numer zatwierdzenia CEC MED UC 16-046, uchwała z dnia 21 kwietnia 2016 r.).

Rekrutacja i charakterystyka pacjentów Zdiagnozowani pacjenci z GC będą rekrutowani z sieci Red UC Christus w Santiago, Chile. Rekrutacja pacjentów i podpisywanie formularzy świadomej zgody, prowadzenie i monitorowanie dokumentacji medycznej pacjentów, ekstrakcji materiału biologicznego i próbek będzie zarządzane przez CITO.

Z historii pacjentów i leczenia wynika, że ​​poza operacją i chemioterapią około 10% pacjentów otrzymywało trastuzumab (terapia celowana ERBB2, zwana także Herceptyną), kolejne 10% otrzymało immunoterapię, w tym pembrolizumab i ipilimumab (inhibitory punktu kontrolnego). Ostatecznie około 5% pacjentów otrzymało terapię antyangiogenną (składającą się z terapii celowanej VEGFR2 z ramucyrumabem). Dodatkowo analiza histologiczna wykazała, że ​​około 50% pacjentów zostało sklasyfikowanych jako typ jelitowy, 30% jako rozlany, a 20% było mieszanych lub nieokreślonych.

Kryteria przyjęcia

• Dorosły mężczyzna lub kobieta w wieku >18 lat
• Zdiagnozowany rak żołądka (histologiczny lub cytologiczny)
• Uczęszczanie do ośrodków zdrowia sieci Red UC Christus przez co najmniej 3 miesiące z obserwacją kliniczną
• Potrafi czytać i mówić po hiszpańsku
• Chęć i zdolność do wyrażenia świadomej pisemnej zgody na badanie, która powinna być opatrzona datą i podpisana w momencie rejestracji.

Kryteria wyłączenia

Pacjenci:

• Z małymi próbkami biopsji niewystarczającymi do analizy.
• których dokumentacja medyczna nie może być zebrana lub jest niedostępna.
• Bez podpisanej świadomej zgody.

Dane kliniczne Dane kliniczne pacjentów będą pozyskiwane przez świadczeniodawców i wprowadzane na internetową platformę elektroniczną. Próbki będą kodowane, a tożsamość pacjenta znana tylko lekarzowi prowadzącemu. Zmienne kliniczne są podzielone na sekcje: Ogólne informacje o pacjencie, Historia raka, Badania laboratoryjne, Wskaźnik współwystępowania (Charlson), Chemioterapia, Skuteczność i obserwacja oraz Toksyczność. Chemioterapia pacjentów zostanie sklasyfikowana według: schematu, liczby cykli i czasu leczenia oraz intensywności dawki chemioterapii w ciągu pierwszych 6 miesięcy. Schematy chemioterapii reprezentujące chemioterapię pierwszego rzutu przepisaną pacjentom. Pełna intensywność dawki chemioterapii w ciągu pierwszych 6 miesięcy zostanie uzyskana poprzez wywiady z pacjentami i wprowadzona bezpośrednio do platformy internetowej. Wreszcie dane dotyczące skuteczności i obserwacji oraz toksyczności uzyskane od pacjentów.

Główne wyniki kliniczne Główne wyniki zostaną wywnioskowane z uzyskanych danych klinicznych, obejmują one przeżycie całkowite, przeżycie wolne od progresji i przeżycia wolnego od nawrotów.

Próbki biologiczne i kompleksowy test Oncomine Materiały biologiczne uzyskane w Red UC Christus zostaną przetransportowane do CEMP w Santiago de Chile zgodnie ze znormalizowanymi protokołami. Łącznie 200 próbek guza pacjenta zostanie uzyskanych z zarchiwizowanych próbek utrwalonych w formalinie zatopionych w parafinie (FFPE). Kwasy nukleinowe będą ekstrahowane przy użyciu zestawu RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) i analizowane przy użyciu dostępnego w handlu zestawu Oncomine Comprehensive Assay. Ten test jednocześnie analizuje DNA i RNA z próbek, umożliwiając ocenę 73 hotspotów genów (na podstawie DNA), 49 ogniskowych zmian liczby kopii (CNV, opartych na DNA), 26 pełnych sekwencji kodujących (dla mutacji i utraty CNV) oraz 22 fuzji genów sterowniki (RNA). Warto zauważyć, że 72 z tych genów to cele dla leków. Uzyskane surowe dane genomowe (.vcf i .pdf pliki) będą przechowywane i archiwizowane w lokalnym centrum danych do późniejszej analizy genomicznej. Po opublikowaniu wyników tego badania wyniki Oncomine wraz z klasyfikacją kliniczną poszczególnych nowotworów zostaną udostępnione publicznie.

Analiza mikromacierzy tkankowych (TMA) Następujące geny będą dalej analizowane przez TMA przy użyciu swoistych przeciwciał przeciwko: PD-L1 (Dako, nr kat. SK00521), PD-L2 (Thermo nr kat. B7-DC/CD273), Abcam nr kat. AB118815), p53 (nr kat. 5278074001), VEGFR2 (nr kat. Abcam AB39256), fosforylowany Akt (nr kat. Thermo 473), HER2 (Roche, nr kat. 05278368001), p16 (Roche, nr kat. 06695221001), Met ( Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) i cztery markery mikrosatelitarne (wszystkie firmy Roche): MLH1 (nr kat. 06472966001), MSH2 (nr kat. 05269270001), MSH6 (nr kat. 5929911001), PMS2 (nr kat. 06419216001). Instrukcja TMA zostanie przygotowana zgodnie z wcześniejszym opisem. W skrócie, bloczki parafinowe zostaną pobrane, pocięte i wybarwione metodą Hematoxylin & Eosin (H&E) w celu wybrania najlepszego obszaru histologicznego. Następnie wybrany obszar tkanki zostanie umieszczony w TMA poprzez zakreślenie zidentyfikowanego obszaru w odpowiednim bloku. Cylindryczne biopsje rdzeniowe zostaną pobrane z każdego bloku parafinowego za pomocą mandrynu 1 mm i umieszczone w nowym bloku biorczym. Wybrane odpowiednie przypadki miały guzy, które zajmowały co najmniej 10% obszaru rdzenia. Każdy przypadek będzie przetwarzany w trzech egzemplarzach, aby zapobiec utracie tkanki podczas cięcia. Skrawki z każdego bloku macierzy tkankowej zostaną pocięte, odparafinowane i odwodnione do procedur H&E i immunohistochemicznych.

Metylacja genu Oceniona zostanie metylacja genu promotora na sześciu wybranych genach, które wcześniej wykazały regulację promotora przez metylację związaną z GC. Analiza metylacji obejmie gen reprimo i inne mRNA związane z progresją GC. Analiza zostanie przeprowadzona przez sekwencjonowanie wodorosiarczynem, jak opisano wcześniej, przy użyciu zestawu EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, potraktowany wodorosiarczynem DNA jest amplifikowany przy użyciu specyficznych starterów do PCR, a produkty PCR są następnie klonowane i sekwencjonowane.

Identyfikacja EBV Podtypy EBV w próbkach pacjentów zostaną ocenione metodą chromogennej hybrydyzacji in situ (CISH) z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) U znacznej części pacjentów z GC może rozwinąć się poważna toksyczność leczenia 5-FU, w tym supresja szpiku kostnego, neuropatia, niska liczba białych krwinek, gorączka, infekcje, nudności, wymioty, ciężka biegunka, jama ustna i przewód pokarmowy zapalenie, z których wszystkie są rejestrowane w historii pacjentów z innych kohort. Subtelne osobiste i populacyjne zmiany w DNA, zwane SNP, mogą odpowiadać za wzrost ryzyka toksyczności 5-FU; Metabolizm 5-FU zachodzi głównie w wątrobie, gdzie enzym DPYD jest odpowiedzialny za metabolizowanie >80% leku, tworząc nieaktywny metabolit 5,6 dihydroksy-5-FU. Powszechnie udokumentowano, że zmniejszona aktywność DPYP jest związana z poważną toksycznością. Niezmetabolizowana frakcja 5-FU (20%) jest przekształcana przez szereg enzymów (np. TP, TK), wytwarzając aktywne metabolity, które spowodują hamowanie TYMS, promując w ten sposób uszkodzenia DNA/RNA. Zmiany w genach TYMS i MTHFR (związane ze zmniejszoną syntezą kwasu foliowego, zwiększonym efektem 5-FU) zostały powiązane z toksycznością leczenia 5-FU. Podejście zastosowane do selekcji wariantów genetycznych polegało na wyszukiwaniu w bazie danych PharmGKB. Przeanalizowanych zostanie łącznie sześć niesynonimicznych SNP: cztery z nich zawierają gen DPYD, jeden dla TYMS i jeden dla MTHFR. Analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu technologii TaqMan™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems™). SNP zostaną ocenione w DNA wyizolowanym z próbek pacjentów zatopionych w parafinie.

Wielkość próby i analiza statystyczna

Minimalna liczba próbek zostanie obliczona w celu zapewnienia pełnej realizacji celów projektu. Biorąc pod uwagę, że około 90% przypadków GC to rzeczywiście GAC, przy 5% poziomie błędu i 95% przedziale ufności, badacze pierwotnie przewidzieli wielkość próby na 200 pacjentów. Jednak badacze wzięli również pod uwagę 15% wskaźnik utraty próbek (wadliwe próbki lub odpady pacjentów), co dało w sumie 230 pacjentów do rekrutacji.

Standardowe statystyki opisowe zostaną wykorzystane do analizy zmiennych jakościowych i ilościowych, takich jak częstości względne i bezwzględne, tablice częstości, średnia, mediana, odchylenie standardowe, rozstęp i kwartyle. 95% pewność zostanie uznana za odpowiednią do analizy. Statystyki opisowe zostaną również wykorzystane do scharakteryzowania najistotniejszych mierzonych parametrów klinicznych. Powiązanie skategoryzowanych zmiennych zostanie przeprowadzone za pomocą testów chi-kwadrat lub dokładnych testów Fishera. Jednoramienna analiza wariancji porówna zmienne ciągłe między grupami. Badania wyników przeżycia zostaną przeprowadzone przy użyciu metody Kaplana-Meiera. Czynniki prognostyczne zostaną ocenione zgodnie z modelem regresji proporcjonalnego hazardu Coxa.

Przeprowadzona zostanie analiza głównych składników (PCA) wariantów genów i ocenione zostanie powiązanie pierwszych głównych składników z niewielkim, wcześniej zdefiniowanym zestawem sygnatur zmian genomowych. Aby zdefiniować podgrupy molekularne, badacze wykorzystają grupowanie bez nadzoru. Korelacja podtypów molekularnych z danymi klinicznymi (np. wiek, płeć, klasa Lauren) i wyniki kliniczne (np. całkowity czas przeżycia, odsetek odpowiedzi) zostaną ocenione. Ponadto na podstawie wyników klinicznych zostanie przeprowadzona nadzorowana klasyfikacja, a otrzymane grupy obu podejść zostaną porównane z innymi zgłoszonymi podtypami molekularnymi.

Ochrona pacjenta/formularze pisemnej świadomej zgody

Wszystkie strony gwarantują ochronę danych osobowych pacjentów. Nazwiska pacjentów nie są umieszczane w żadnej formie w raportach, publikacjach ani w żadnym rodzaju publikowanym dokumencie pochodzącym z badania, z wyjątkiem dokumentów wymaganych przez prawo. Formularze świadomej zgody są opracowywane ściśle według przepisów prawa i lokalnych przepisów. Pisemne formularze świadomej zgody, w tym wszystkie zmiany wprowadzone w trakcie badania, muszą zostać zatwierdzone prospektywnie przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną/niezależną Komisję ds. Etyki oraz CEMP przed włączeniem do badania.

Badacze, przedstawiciele lub pracownicy służby zdrowia uzyskają pisemne formularze świadomej zgody od każdego pacjenta lub przedstawiciela prawnego przed wykonaniem jakiejkolwiek określonej czynności w ramach badania.