Task Force Chileno de Cáncer Gástrico (FORCE 1) (FORCE-1)

Entidades participantes: El Grupo de Trabajo de Cáncer Gástrico de Chile (GCTF) es un esfuerzo colectivo entre dos identidades principales: 1- El Centro de Excelencia de Medicina de Precisión (CEMP), que fue establecido a través de un financiamiento conjunto de la agencia gubernamental para el desarrollo económico (Corporación de Fomento de la Producción, CORFO) y Pfizer Chile y 2- El Centro de Investigación en Oncología UC (CITO) con sede en la Pontificia Universidad Católica de Chile. Ambas entidades son organizaciones de investigación sin fines de lucro destinadas a mejorar la educación pública e implementar estrategias para mejorar los resultados clínicos en el tratamiento oncológico y la prevención del cáncer.

Objetivo primario: Estratificar a los pacientes chilenos con GC en subgrupos pronósticos y correlacionar la respuesta a la terapia según alteraciones clínicas, proteicas, epigenéticas y genéticas en una cohorte de 200 pacientes con GAC.

Objetivos secundarios

• Determinar el perfil mutacional en pacientes chilenos con CG.
• Evaluar el porcentaje de pacientes chilenos con CG que podrían beneficiarse de los objetivos farmacológicos disponibles actualmente (genes procesables).
• Correlacionar la presencia de VEB con parámetros clínicos.
• Para evaluar los niveles de expresión de proteínas asociadas con estratificaciones moleculares y terapias dirigidas actualmente (p. PD-L1 y antiangiogénicos)
• Determinar el perfil de SNPs en los genes DPYD y TYMS en pacientes chilenos con CG y su correlación con eventos adversos.

Diseño del estudio

Aprobación ética El GCTF es un estudio no intervencionista, colaborativo, prospectivo no concurrente que busca estratificar a los pacientes con GAC en función de su pronóstico y respuesta a la terapia. El estudio cumplirá estrictamente con todos los requisitos legales, reglamentarios y principios generales establecidos por los organismos internacionales que rigen la conducta ética en la investigación biomédica en seres humanos, siguiendo las buenas prácticas clínicas y la declaración de Helsinki. El protocolo del estudio GCTF ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario (Pontificia Universidad Católica de Chile, CEC MED UC número de aprobación 16-046, resolución del 21 de abril de 2016).

Reclutamiento y características de los pacientes Los pacientes con GC diagnosticados serán reclutados de la red Red UC Christus en Santiago, Chile. El CITO gestionará el reclutamiento de pacientes y la firma de formularios de consentimiento informado, el mantenimiento y seguimiento de los registros médicos de los pacientes, el material biológico y las extracciones de muestras.

El historial del paciente y del tratamiento revela que, además de la cirugía y la quimioterapia, aproximadamente el 10 % de los pacientes recibieron Trastuzumab (terapia dirigida con ERBB2, también llamada Herceptin), otro 10 % recibió inmunoterapia, incluidos pembrolizumab e ipilimumab (inhibidores de puntos de control). Finalmente, aproximadamente el 5 % de los pacientes recibieron terapia antiangiogénica (que consiste en una terapia dirigida de VEGFR2 con ramucirumab). Además, el análisis histológico mostró que aproximadamente el 50 % de los pacientes se clasificaron como de tipo intestinal, el 30 % como difusos y el 20 % como mixtos o indeterminados.

Criterios de inclusión

• Hombre o mujer adulto mayor de 18 años
• Diagnosticado con cáncer gástrico (histológico o citológico)
• Asistir a los centros de salud de la red Red UC Christus durante al menos 3 meses con seguimiento clínico
• Capaz de leer y hablar español.
• Dispuesto y capaz de proporcionar un consentimiento informado por escrito para el estudio que debe estar fechado y firmado en el momento de la inscripción.

Criterio de exclusión

Pacientes:

• Con muestras de biopsia pequeñas insuficientes para el análisis.
• Cuyos registros médicos no se pueden recopilar o no están disponibles.
• Sin consentimiento informado firmado.

Datos clínicos Los proveedores de atención médica obtendrán los datos clínicos de los pacientes y los ingresarán en una plataforma electrónica en línea. Las muestras se codificarán y la identidad del paciente solo será conocida por el médico tratante. Las variables clínicas se dividen en secciones: Información general del paciente, Historia del cáncer, Estudios de laboratorio, Índice de comorbilidad (Charlson), Quimioterapia, Eficacia y seguimiento y Toxicidad. La quimioterapia del paciente se clasificará por: régimen, número de ciclos y tiempo de tratamiento e intensidad de la dosis de quimioterapia durante los primeros 6 meses. Regímenes de quimioterapia que representan la quimioterapia de primera línea prescrita a los pacientes. La intensidad total de la dosis de quimioterapia durante los primeros 6 meses se obtendrá a través de entrevistas con los pacientes y se ingresará directamente en la plataforma en línea. Finalmente, los datos de eficacia y seguimiento y toxicidad obtenidos de los pacientes.

Principales resultados clínicos Los principales resultados se deducirán de los datos clínicos obtenidos, estos incluyen tasas de supervivencia global, libre de progresión y libre de recurrencia.

Muestras biológicas y Ensayo Integral Oncomine Los materiales biológicos obtenidos en la Red UC Christus serán transportados al CEMP en Santiago de Chile bajo protocolos estandarizados. Se obtendrá un total de 200 muestras de tumores de pacientes a partir de muestras archivadas incluidas en parafina fijada con formalina (FFPE). Los ácidos nucleicos se extraerán con el kit RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) y se analizarán con el kit Oncomine Comprehensive Assay disponible en el mercado. Este ensayo analiza simultáneamente el ADN y el ARN de las muestras, lo que permite la evaluación de 73 puntos críticos de genes (basados ​​en el ADN), 49 variaciones del número de copias focales (CNV, basadas en ADN), 26 secuencias de codificación completas (para mutaciones y pérdida de CNV) y 22 fusiones de genes. controladores (ARN). En particular, 72 de estos genes son dianas farmacológicas. Datos brutos genómicos obtenidos (.vcf y .pdf archivos) se almacenarán y se realizará una copia de seguridad en un centro de datos local para su posterior análisis genómico. Tras la publicación de los hallazgos de este estudio, los resultados de Oncomine junto con la clasificación clínica de los tumores individuales se pondrán a disposición del público.

Análisis de Micro Array de Tejido (TMA) Los siguientes genes serán analizados más a fondo por un TMA usando anticuerpos específicos contra: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat # B7-DC/CD273), mTOR fosforilado ( Abcam Cat n.° AB118815), p53 (Cat n.° 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat n.° AB39256), Akt fosforilado (Thermo Cat n.° 473), HER2 (Roche, Cat n.° 05278368001), p16 (Roche, Cat n.° 06695221001), Met ( Abcam Cat n.° AB51067), HA-4 (Abcam Cat n.° AB24480) y cuatro marcadores de microsatélites (todos de Roche): MLH1 (Cat. n.° 06472966001), MSH2 (Cat. n.° 05269270001), MSH6 (Cat. n.° 5929911001), PMS2 (Cat. n.° 06419216001). El TMA manual se preparará como se describió anteriormente. En resumen, se obtendrán bloques de parafina que se cortarán y teñirán con Hematoxilina y Eosina (H&E) para seleccionar la mejor zona histológica. Posteriormente, el área de tejido seleccionada se colocará en el TMA haciendo un círculo alrededor del área identificada en el bloque correspondiente. Se extraerán biopsias de núcleo cilíndrico de cada bloque de parafina con un estilete de 1 mm y se colocarán en un nuevo bloque receptor. Los casos adecuados seleccionados tenían tumores que ocupaban al menos el 10% del área central. Cada caso se procesará por triplicado para evitar la pérdida de tejido durante el corte. Las secciones de cada bloque de matriz de tejidos se cortarán, desparafinarán y deshidratarán para procedimientos de H&E e inmunohistoquímicos.

Metilación del gen Se evaluará la metilación del gen del promotor en seis genes seleccionados que han mostrado previamente regulación del promotor por metilación asociada con GC. El análisis de metilación incluirá el gen reprimo y otros ARNm asociados con la progresión de GC. El análisis se realizará mediante secuenciación con bisulfito como se describió anteriormente utilizando el kit EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) con modificaciones menores. Brevemente, el ADN tratado con bisulfito se amplifica utilizando cebadores de PCR específicos, y los productos de PCR se clonan y secuencian posteriormente.

Identificación de EBV Los subtipos de EBV en muestras de pacientes se evaluarán mediante el método de hibridación cromogénica in situ (CISH) con modificaciones menores.

Análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP) Una proporción significativa de pacientes con GC puede desarrollar toxicidad grave a partir del tratamiento con 5-FU, incluida supresión de la médula ósea, neuropatía, recuento bajo de glóbulos blancos, fiebre, infecciones, náuseas, vómitos, diarrea intensa, en la boca y el tracto digestivo inflamación, todo lo cual se registra en el historial del paciente de otras cohortes. Sutiles cambios personales y poblacionales en el ADN, llamados SNP, pueden explicar los aumentos en el riesgo de toxicidad por 5-FU; El metabolismo del 5-FU es predominantemente hepático, donde la enzima DPYD es responsable de metabolizar >80% del fármaco, produciendo el metabolito inactivo 5,6 dihidroxi-5-FU. Está ampliamente documentado que una disminución de la actividad de DPYP se asocia con una toxicidad grave. La fracción no metabolizada de 5-FU (20 %) es transformada por una serie de enzimas (por ejemplo, TP, TK), produciendo los metabolitos activos que causarán la inhibición de TYMS, promoviendo así el daño del ADN/ARN. Las variaciones en los genes TYMS y MTHFR (relacionadas con la reducción de la síntesis de folato, aumento del efecto del 5-FU) se han asociado con toxicidad por el tratamiento con 5-FU. El enfoque que se utilizó para seleccionar las variantes genéticas consistió en una búsqueda en la base de datos PharmGKB. Se analizarán un total de seis SNP no sinónimos: cuatro de ellos comprenden el gen DPYD, uno para TYMS y uno para MTHFR. El análisis se realizará utilizando la tecnología de ensayo de genotipado de SNP TaqMan™ (Applied Biosystems™). Los SNP se evaluarán en ADN aislado de muestras de pacientes incrustadas en parafina.

Tamaño de la muestra y análisis estadístico

El número mínimo de muestra se calculará para garantizar que los objetivos del proyecto se cumplan por completo. Teniendo en cuenta que aproximadamente el 90 % de los casos de GC son de hecho GAC, con una tasa de error del 5 % y un intervalo de confianza del 95 %, los investigadores originalmente proyectaron un tamaño de muestra de 200 pacientes. Sin embargo, los investigadores también consideraron una tasa de pérdida de muestras del 15% (muestras defectuosas o abandono de pacientes), lo que dio un total de 230 pacientes para reclutar.

Se utilizarán estadísticas descriptivas estándar para analizar variables cualitativas y cuantitativas, como frecuencias relativas y absolutas, tablas de frecuencia, promedio, mediana, desviación estándar, rango y cuartiles. Una confianza del 95% se considerará adecuada para el análisis. También se utilizará estadística descriptiva para caracterizar los parámetros clínicos más relevantes medidos. La asociación de las variables categorizadas se realizará mediante chi-cuadrado o pruebas exactas de Fisher. El análisis de varianza de un brazo comparará variables continuas entre grupos. Los estudios de resultados de supervivencia se realizarán utilizando el método de Kaplan-Meier. Los factores pronósticos se evaluarán de acuerdo con el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox.

Se realizará un análisis de componentes principales (PCA) de las variantes de genes y se evaluará la asociación de los primeros componentes principales con un pequeño conjunto predefinido de firmas de alteración genómica. Para definir los subgrupos moleculares, los investigadores utilizarán la agrupación no supervisada. La correlación de los subtipos moleculares con datos clínicos (p. edad, sexo, clase Lauren) y resultados clínicos (p. supervivencia global, tasa de respuesta). Además, la clasificación supervisada se realizará en función de los resultados clínicos y los grupos resultantes de ambos enfoques se compararán con otros subtipos moleculares informados.

Protección del paciente/formularios de consentimiento informado por escrito

Todas las partes garantizan la protección de los registros personales de los pacientes. Los nombres de los pacientes no se incluyen de ninguna forma en hojas-informes, publicaciones o en cualquier tipo de documento publicable derivado del estudio, con excepción de los documentos requeridos por ley. Los formularios de consentimiento informado se elaboran siguiendo estrictamente las normas legales y locales. Los formularios de consentimiento informado por escrito, incluidos todos los cambios realizados a lo largo del estudio, deben ser aprobados prospectivamente por la Junta de revisión interna/Comité de ética independiente y el CEMP antes de incorporarse al estudio.

Los investigadores, representantes o proveedores de atención médica obtendrán formularios de consentimiento informado por escrito de cada paciente o representante legal antes de realizar cualquier actividad específica del estudio.