Чилийская целевая группа по раку желудка (FORCE 1) (FORCE-1)

Участвующие организации: Чилийская рабочая группа по раку желудка (GCTF) представляет собой совместную работу двух основных организаций: 1- Центр передового опыта в области точной медицины (CEMP), который был создан при совместном финансировании со стороны государственного агентства экономического развития (Corporacion de Fomento de la Produccion, CORFO) и Pfizer Chile и 2- Центр UC по исследованиям в области онкологии (CITO) на базе Папского католического университета Чили. Обе организации являются некоммерческими исследовательскими организациями, целью которых является повышение уровня просвещения населения и реализация стратегий, направленных на улучшение клинических результатов лечения онкологических заболеваний и профилактики рака.

Основная цель: разделить чилийских пациентов с РЖ на прогностические подгруппы и сопоставить ответ на терапию в соответствии с клиническими, белковыми, эпигенетическими и генетическими изменениями в когорте из 200 пациентов с ГАК.

Второстепенные цели

• Определить профиль мутаций у чилийских пациентов с РЖ.
• Оценить процент чилийских пациентов с РЖ, которым могли бы помочь доступные в настоящее время лекарственные мишени (действующие гены).
• Соотнести присутствие ВЭБ с клиническими параметрами.
• Для оценки уровней экспрессии белков, связанных с молекулярной стратификацией и применяемой в настоящее время таргетной терапией (например, PD-L1 и антиангиогенные средства)
• Определить профиль SNP в генах DPYD и TYMS у чилийских больных РЖ и их корреляцию с нежелательными явлениями.

Дизайн исследования

Одобрение этики GCTF — это неинтервенционное, совместное, проспективное непараллельное исследование, целью которого является стратификация пациентов с GAC на основе их прогноза и ответа на терапию. В исследовании будут строго соблюдаться все юридические требования, положения и общие принципы, установленные международными агентствами, регулирующие этическое поведение при проведении биомедицинских исследований на людях, в соответствии с надлежащей клинической практикой и Хельсинкской декларацией. Протокол исследования GCTF был одобрен Комитетом по этике университетской больницы (Pontificia Universidad Catolica de Chile, номер утверждения CEC MED UC 16-046, резолюция от 21 апреля 2016 г.).

Набор и характеристики пациентов Пациенты с диагностированным РЖ будут набраны из сети Red UC Christus в Сантьяго, Чили. CITO будет управлять набором пациентов и подписанием форм информированного согласия, ведением и мониторингом медицинских карт пациентов, извлечением биологических материалов и образцов.

История пациентов и лечение показывает, что помимо хирургического вмешательства и химиотерапии примерно 10% пациентов получали трастузумаб (таргетная терапия ERBB2, также называемая герцептином), еще 10% получали иммунотерапию, включая пембролизумаб и ипилимумаб (ингибиторы контрольных точек). Наконец, примерно 5% пациентов получали антиангиогенную терапию (состоящую из таргетной терапии VEGFR2 с рамуцирумабом). Кроме того, гистологический анализ показал, что примерно 50% пациентов были классифицированы как кишечный тип, 30% — как диффузный, а 20% — как смешанный или неопределенный.

Критерии включения

• Взрослый мужчина или женщина старше 18 лет
• Диагностирован рак желудка (гистологически или цитологически)
• Посещение медицинских центров сети Red UC Christus в течение не менее 3 месяцев с последующим клиническим наблюдением.
• Способен читать и говорить по-испански
• Желание и возможность предоставить письменное информированное согласие на исследование, которое должно быть датировано и подписано во время зачисления.

Критерий исключения

Пациенты:

• С небольшими образцами биопсии недостаточно для анализа.
• Чьи медицинские записи не могут быть собраны или недоступны.
• Без подписанного информированного согласия.

Клинические данные Клинические данные пациентов будут получены поставщиками медицинских услуг и введены в электронную онлайн-платформу. Образцы будут закодированы, а личность пациента известна только лечащему врачу. Клинические переменные разделены на разделы: Общая информация о пациенте, История рака, Лабораторные исследования, Индекс сопутствующих заболеваний (Чарльсона), Химиотерапия, Эффективность и последующее наблюдение и Токсичность. Химиотерапия пациента будет классифицироваться по: режиму, количеству циклов и времени лечения, а также интенсивности дозы химиотерапии в течение первых 6 месяцев. Схемы химиотерапии, представляющие химиотерапию первой линии, назначаемые пациентам. Полная интенсивность дозы химиотерапии в течение первых 6 месяцев будет получена путем опроса пациентов и введена непосредственно на онлайн-платформу. Наконец, данные об эффективности, последующем наблюдении и токсичности, полученные от пациентов.

Основные клинические исходы Основные исходы будут выводиться из полученных клинических данных, к ним относятся общая выживаемость, показатели выживаемости без прогрессирования и без рецидивов.

Биологические образцы и комплексный анализ Oncomine Биологические материалы, полученные в Red UC Christus, будут доставлены в CEMP в Сантьяго-де-Чили в соответствии со стандартными протоколами. В общей сложности 200 образцов опухолей пациентов будут получены из архивных образцов, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE). Нуклеиновые кислоты будут экстрагированы с использованием набора RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) и проанализированы с использованием имеющегося в продаже набора для комплексного анализа Oncomine. Этот анализ одновременно анализирует ДНК и РНК из образцов, что позволяет оценить 73 горячих точки генов (на основе ДНК), 49 вариаций числа фокальных копий (CNV, на основе ДНК), 26 полных кодирующих последовательностей (для мутаций и потери CNV) и 22 слияния генов. драйверы (РНК). Примечательно, что 72 из этих генов являются мишенями для лекарств. Получены необработанные геномные данные (.vcf и .pdf файлы) будут храниться и резервироваться в локальном центре обработки данных для последующего геномного анализа. После публикации результатов этого исследования результаты Oncomine вместе с клинической классификацией отдельных опухолей будут обнародованы.

Анализ с помощью тканевого микрочипа (ТМА) Следующие гены будут дополнительно проанализированы с помощью ТМА с использованием специфических антител против: PD-L1 (Dako, номер по каталогу SK00521), PD-L2 (термо номер по каталогу B7-DC/CD273), фосфорилированного mTOR ( Abcam Cat # AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat # AB39256), фосфорилированный Akt (Thermo Cat # 473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 06695221001), Met ( Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) и четыре микросателлитных маркера (все от Roche): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5929911001), PMS2 (Cat # 06419216001). Ручной TMA будет подготовлен, как описано ранее. Вкратце, парафиновые блоки будут получены, вырезаны и окрашены гематоксилином и эозином (H&E), чтобы выбрать наилучшую гистологическую область. Впоследствии выбранная область ткани будет помещена в ТМА путем обведения идентифицированной области в соответствующем блоке. Цилиндрические сердцевинные биопсии будут извлечены из каждого парафинового блока с помощью стилета диаметром 1 мм и помещены в новый реципиентный блок. Отобранные адекватные случаи имели опухоли, которые занимали не менее 10% площади ядра. Каждый случай будет обработан в трех экземплярах, чтобы предотвратить потерю ткани во время резки. Срезы из каждого блока массива тканей будут вырезаны, депарафинированы и обезвожены для H&E и иммуногистохимических процедур.

Метилирование гена Будет оцениваться метилирование гена промотора в шести выбранных генах, которые ранее демонстрировали регуляцию промотора посредством метилирования, связанного с GC. Анализ метилирования будет включать ген репримо и другие мРНК, связанные с прогрессированием GC. Анализ будет проводиться с помощью бисульфитного секвенирования, как описано ранее, с использованием набора EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) с небольшими модификациями. Вкратце, ДНК, обработанную бисульфитом, амплифицируют с использованием специфических праймеров для ПЦР с последующим клонированием и секвенированием продуктов ПЦР.

Идентификация EBV Подтипы EBV в образцах пациентов будут оцениваться с использованием метода хромогенной гибридизации in situ (CISH) с небольшими модификациями.

Анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) У значительной части пациентов с РЖ может развиться серьезная токсичность при лечении 5-ФУ, включая супрессию костного мозга, невропатию, низкое количество лейкоцитов, лихорадку, инфекции, тошноту, рвоту, тяжелую диарею, поражение полости рта и желудочно-кишечного тракта. воспаления, все из которых зарегистрированы в анамнезе пациентов других когорт. Незначительные индивидуальные и популяционные изменения в ДНК, называемые SNP, могут объяснить увеличение риска токсичности 5-FU; Метаболизм 5-ФУ происходит преимущественно в печени, где фермент DPYD отвечает за метаболизм >80% препарата с образованием неактивного метаболита 5,6-дигидрокси-5-ФУ. Широко известно, что снижение активности DPYP связано с тяжелой токсичностью. Неметаболизированная фракция 5-ФУ (20%) трансформируется рядом ферментов (например, TP, TK), образуя активные метаболиты, которые вызывают ингибирование TYMS, тем самым способствуя повреждению ДНК/РНК. Изменения в генах TYMS и MTHFR (связанные со сниженным синтезом фолиевой кислоты, усиленным эффектом 5-ФУ) были связаны с токсичностью при лечении 5-ФУ. Подход, который использовался для выбора генетических вариантов, заключался в поиске в базе данных PharmGKB. Всего будет проанализировано шесть несинонимичных SNP: четыре из них включают ген DPYD, один для TYMS и один для MTHFR. Анализ будет проводиться с использованием технологии TaqMan™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems™). SNP будут оцениваться в ДНК, выделенной из образцов пациентов, залитых парафином.

Размер выборки и статистический анализ

Минимальное количество образцов будет рассчитано для обеспечения полного достижения целей проекта. Принимая во внимание, что примерно 90% случаев РЖ действительно связаны с ГАК, при частоте ошибок 5% и доверительном интервале 95% исследователи первоначально прогнозировали размер выборки в 200 пациентов. Однако исследователи также учли 15-процентный уровень потери образцов (дефектные образцы или выбывание пациентов), в результате чего было набрано в общей сложности 230 пациентов.

Стандартная описательная статистика будет использоваться для анализа качественных и количественных переменных, таких как относительная и абсолютная частота, таблицы частот, среднее значение, медиана, стандартное отклонение, диапазон и квартили. Достоверность 95% будет считаться приемлемой для анализа. Описательная статистика также будет использоваться для характеристики наиболее важных измеряемых клинических параметров. Ассоциация классифицированных переменных будет выполняться с помощью критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Дисперсионный анализ с одной рукой будет сравнивать непрерывные переменные между группами. Исследования результатов выживания будут проводиться с использованием метода Каплана-Мейера. Прогностические факторы будут оцениваться в соответствии с регрессионной моделью пропорциональных рисков Кокса.

Будет проведен анализ основных компонентов (PCA) вариантов генов, и будет оценена ассоциация первых основных компонентов с небольшим заранее определенным набором сигнатур геномных изменений. Чтобы определить молекулярные подгруппы, исследователи будут использовать неконтролируемую кластеризацию. Корреляция молекулярных подтипов с клиническими данными (например, возраст, пол, класс Лорен) и клинические исходы (например, общая выживаемость, частота ответов) будут оцениваться. Кроме того, контролируемая классификация будет проводиться на основе клинических результатов, и полученные группы обоих подходов будут сравниваться с другими зарегистрированными молекулярными подтипами.

Защита пациентов/формы письменного информированного согласия

Все стороны гарантируют защиту личных данных пациентов. Имена пациентов ни в какой форме не включаются в листы-отчеты, публикации или какие-либо публикуемые документы, полученные в результате исследования, за исключением документов, требуемых по закону. Формы информированного согласия разрабатываются в строгом соответствии с законодательными и местными нормами. Формы письменного информированного согласия, включая все изменения, внесенные в ходе исследования, должны быть предварительно одобрены Внутренним наблюдательным советом/независимым комитетом по этике и CEMP до того, как они будут включены в исследование.

Исследователи, представители или поставщики медицинских услуг получат письменные формы информированного согласия от каждого пациента или законного представителя до выполнения какой-либо конкретной деятельности в рамках исследования.