Chilensk arbeidsgruppe for magekreft (FORCE 1) (FORCE-1)

Deltakende enheter: The Chilean Gastric Cancer Task Force (GCTF) er en kollektiv innsats mellom to hovedidentiteter: 1- The Center of Excellence of Precision Medicine (CEMP), som ble etablert gjennom en felles finansiering av det offentlige byrået for økonomisk utvikling (Corporacion) de Fomento de la Produccion, CORFO) og Pfizer Chile og 2- The Center UC for Investigation in Oncology (CITO) med base ved Pontificia Universidad Católica de Chile. Begge enhetene er non-profit forskningsorganisasjoner som tar sikte på å forbedre offentlig utdanning og implementere strategier for å forbedre kliniske resultater innen onkologisk behandling og kreftforebygging.

Primært mål: Å stratifisere chilenske GC-pasienter i prognostiske undergrupper, og å korrelere terapirespons i henhold til kliniske, protein-, epigenetiske og genetiske endringer i en kohort på 200 GAC-pasienter.

Sekundære mål

• For å bestemme mutasjonsprofilen hos chilenske GC-pasienter.
• For å vurdere prosentandelen av chilenske GC-pasienter som kan dra nytte av tilgjengelige medisinerbare mål (handlingsbare gener).
• For å korrelere EBV-tilstedeværelse til kliniske parametere.
• For å vurdere ekspresjonsnivåene til proteiner assosiert med molekylære stratifikasjoner og for tiden målrettede terapier (f. PD-L1 og antiangiogene midler)
• For å bestemme profilen til SNP-er i DPYD- og TYMS-genene hos chilenske GC-pasienter og deres korrelasjon med uønskede hendelser.

Studere design

Etikkgodkjenning GCTF er en ikke-intervensjonell, samarbeidende, prospektiv ikke-samtidig studie som søker å stratifisere GAC-pasienter basert på deres prognose og terapirespons. Studien vil strengt overholde alle lovkrav, forskrifter og generelle prinsipper etablert av internasjonale byråer som regulerer etisk oppførsel i biomedisinsk forskning på mennesker, i henhold til god klinisk praksis og Helsinki-erklæringen. GCTF-studieprotokollen er godkjent av den etiske komiteen ved universitetssykehuset (Pontificia Universidad Catolica de Chile, CEC MED UC godkjenningsnummer 16-046, vedtak datert 21. april 2016).

Pasientrekruttering og egenskaper Diagnostiserte GC-pasienter vil bli rekruttert fra Red UC Christus-nettverket i Santiago, Chile. Pasientrekruttering og signering av informerte samtykkeskjemaer, vedlikehold og overvåking av pasientjournaler, biologisk materiale og prøveuttak vil bli administrert av CITO.

Pasient- og behandlingshistorie avslører at foruten kirurgi og kjemoterapi, fikk omtrent 10 % av pasientene Trastuzumab (ERBB2-målrettet terapi, også kalt Herceptin), ytterligere 10 % fikk immunterapi inkludert pembrolizumab og Ipilimumab (sjekkpunkthemmere). Til slutt fikk omtrent 5 % av pasientene antiangiogene terapi (bestående av VEGFR2-målrettet terapi med Ramucirumab). I tillegg viste histologisk analyse at omtrent 50 % av pasientene ble klassifisert som tarmtype, 30 % som diffuse, og 20 % var enten blandede eller ubestemte.

Inklusjonskriterier

• Voksen mann eller kvinne, over 18 år
• Diagnostisert med magekreft (histologisk eller cytologisk)
• Gå på helsesentre i Red UC Christus-nettverket i minst 3 måneder med klinisk oppfølging
• Kan lese og snakke spansk
• Villig og i stand til å gi skriftlig informert samtykke til studien som skal dateres og signeres ved påmelding.

Eksklusjonskriterier

Pasienter:

• Med små biopsiprøver er utilstrekkelig for analyse.
• Hvis medisinske journaler ikke kan samles inn eller er utilgjengelige.
• Uten underskrevet informert samtykke.

Kliniske data Kliniske data fra pasienter vil innhentes av helsepersonell og legges inn på en elektronisk elektronisk plattform. Prøver vil bli kodet og pasientens identitet er kun kjent for den behandlende legen. Kliniske variabler er delt inn i seksjoner: Generell pasientinformasjon, krefthistorie, laboratoriestudier, komorbiditetsindeks (Charlson), kjemoterapi, effekt og oppfølging og toksisitet. Pasientkjemoterapi vil bli klassifisert etter: regime, antall sykluser og behandlingstidspunkt og kjemoterapidoseintensitet i løpet av de første 6 månedene. Kjemoterapiregimer som representerer førstelinjekjemoterapi foreskrevet til pasientene. Full kjemoterapidoseintensitet i løpet av de første 6 månedene vil bli oppnådd gjennom pasientintervjuer og legges inn direkte på nettplattformen. Til slutt, data om effekt og oppfølging og toksisitet fra pasienter.

Hovedutfall Hovedresultater vil bli utledet fra innhentede kliniske data, disse inkluderer total overlevelse, progresjonsfri og residivfri overlevelse.

Biologiske prøver og Oncomine Comprehensive Assay Biologiske materialer oppnådd ved Red UC Christus vil bli transportert til CEMP i Santiago de Chile under standardiserte protokoller. Totalt 200 pasienttumorprøver vil bli hentet fra arkiverte prøver med formalinfiksert parafininnstøpt (FFPE). Nukleinsyrer vil bli ekstrahert ved hjelp av RecoverAll-settet (Thermo Fisher Cat #AM1975) og analysert med det kommersielt tilgjengelige Oncomine Comprehensive Assay-settet. Denne analysen analyserer samtidig DNA og RNA fra prøver som tillater vurdering av 73 gen-hotspots (basert på DNA), 49 fokalkopinummervariasjoner (CNV-er, DNA-baserte), 26 fullstendige kodende sekvenser (for mutasjoner og CNV-tap) og 22 genfusjon drivere (RNA). Spesielt er 72 av disse genene medisinmål. Genomiske rådata innhentet (.vcf og .pdf filer) vil bli lagret og sikkerhetskopiert i et lokalt datasenter for påfølgende genomisk analyse. Ved publisering av funnene fra denne studien vil Oncomine-resultatene sammen med klinisk klassifisering av individuelle svulster gjøres offentlig tilgjengelig.

Tissue Micro Array (TMA)-analyse Følgende gener vil bli videre analysert av en TMA ved bruk av spesifikke antistoffer mot: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat# B7-DC/CD273), Fosforylert mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat #AB39256), Phosphoryated Akt (Thermo Cat #473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Katt # 221609, Met51) Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) og fire mikrosatellittmarkører (alle fra Roche): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5902999), P1MS 06419216001). Manuell TMA vil bli utarbeidet som beskrevet tidligere. Kort fortalt vil parafinblokker bli oppnådd og kuttet og farget med Hematoxylin & Eosin (H&E) for å velge det beste histologiske området. Senere valgt vevsområde vil bli plassert i TMA ved å sirkle det identifiserte området i den tilsvarende blokken. Sylindriske kjernebiopsier vil bli ekstrahert fra hver parafinblokk med en 1 mm stilett og plassert i en ny mottakerblokk. Utvalgte tilstrekkelige tilfeller hadde svulster som okkuperte minst 10 % av kjerneområdet. Hver sak vil bli behandlet i tre eksemplarer for å forhindre tap av vev under kutting. Seksjoner fra hver vevsgruppeblokk vil bli kuttet, avparafinisert og dehydrert for H&E og immunhistokjemiske prosedyrer.

Genmetylering Promotorgen-metylering på seks utvalgte gener som tidligere har vist promotorregulering ved metylering assosiert med GC vil bli vurdert. Metyleringsanalyse vil inkludere reprimo-genet og andre mRNA-er assosiert med GC-progresjon. Analyse vil bli utført ved bisulfitt-sekvensering som beskrevet tidligere ved bruk av EZ DNA methylation Gold kit (Zymo Research) med mindre modifikasjoner. Kort fortalt blir bisulfittbehandlet DNA amplifisert ved å bruke spesifikke PCR-primere, med PCR-produkter som deretter klones og sekvenseres.

EBV-identifikasjon EBV-subtyper i pasientprøver vil bli vurdert ved bruk av den kromogene in situ hybridiseringsmetoden (CISH) med mindre modifikasjoner.

Enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP)-analyse En betydelig andel av GC-pasienter kan utvikle alvorlig toksisitet fra 5-FU-behandling inkludert benmargssuppresjon, nevropati, lavt antall hvite blodlegemer, feber, infeksjoner, kvalme, oppkast, alvorlig diaré, munn og fordøyelseskanal inflammasjon, som alle er registrert i pasienthistorien til andre kohorter. Subtile personlige og populasjonsendringer i DNA, kalt SNP-er, kan forklare økninger i risikoen for 5-FU-toksisitet; 5-FU metabolisme er hovedsakelig hepatisk, hvor enzymet DPYD er ansvarlig for metabolisering av >80 % av legemidlet, og produserer den inaktive metabolitten 5,6 dihydroksy-5-FU. Det er bredt dokumentert at en redusert DPYP-aktivitet er assosiert med alvorlig toksisitet. Ikke-metabolisert fraksjon av 5-FU (20%) blir transformert av en rekke enzymer (f.eks. TP, TK), og produserer de aktive metabolittene som vil forårsake TYMS-hemming, og dermed fremme DNA/RNA-skade. Variasjoner i TYMS- og MTHFR-gener (relatert til redusert folatsyntese, økt 5-FU-effekt) har blitt assosiert med toksisitet ved behandling med 5-FU. Tilnærmingen som ble brukt for å velge de genetiske variantene besto av et søk i databasen, PharmGKB. Totalt seks ikke-synonyme SNP-er vil bli analysert: fire av dem omfatter DPYD-genet, en for TYMS og en for MTHFR. Analyse vil bli utført ved bruk av TaqMan™ SNP Genotyping Assay-teknologi (Applied Biosystems™). SNP-er vil bli vurdert i DNA isolert fra parafininnstøpte pasientprøver.

Prøvestørrelse og statistisk analyse

Minimumsprøveantallet vil bli beregnet for å sikre at målene for prosjektet er fullt ut oppnådd. Tatt i betraktning at omtrent 90 % av GC-tilfellene faktisk er GAC, ved 5 % feilrate og ved 95 % konfidensintervall anslått etterforskerne opprinnelig en prøvestørrelse på 200 pasienter. Men etterforskerne har også vurdert en 15 % rate av prøvetap (defekte prøver eller pasientfrafall), noe som ga totalt 230 pasienter som ble rekruttert.

Standard deskriptiv statistikk vil bli brukt for å analysere kvalitative og kvantitative variabler, som relative og absolutte frekvenser, frekvenstabeller, gjennomsnitt, median, standardavvik, rekkevidde og kvartiler. En 95 % konfidens vil bli ansett som passende for analyse. Deskriptiv statistikk vil også bli brukt for å karakterisere de mest relevante kliniske parametere som er målt. Assosiasjonen av kategoriserte variabler vil bli utført ved hjelp av kjikvadrat eller Fishers eksakte tester. En arm variansanalyse vil sammenligne kontinuerlige variabler mellom grupper. Overlevelsesutfallsstudier vil bli utført ved bruk av Kaplan-Meier-metoden. Prognostiske faktorer vil bli evaluert i henhold til Cox proporsjonal hazards regresjonsmodell.

Hovedkomponentanalyse (PCA) av genvariantene vil bli utført og assosiasjonen av de første hovedkomponentene med et lite forhåndsdefinert sett med genomiske endringssignaturer vil bli vurdert. For å definere molekylære undergrupper, vil etterforskerne bruke uovervåket klynging. Korrelasjonen av de molekylære subtypene med kliniske data (f.eks. alder, kjønn, Lauren-klasse) og kliniske utfall (f.eks. total overlevelse, svarprosent) vil bli vurdert. Videre vil overvåket klassifisering bli utført basert på kliniske utfall og de resulterende gruppene av begge tilnærmingene vil bli sammenlignet med andre rapporterte molekylære subtyper.

Pasientvern/skriftlig informert samtykkeskjema

Alle parter garanterer beskyttelse av pasientenes personlige journaler. Pasientnavn er ikke inkludert i noen form i arkrapporter, publikasjoner eller i noen form for publiserbare dokumenter som stammer fra studien, med unntak av dokumenter som kreves ved lov. Skjemaer for informert samtykke er utarbeidet i henhold til lovlige og lokale forskrifter. De skriftlige informerte samtykkeskjemaene, inkludert alle endringer som gjøres gjennom studien, må prospektivt godkjennes av Internal Review Board/den uavhengige etiske komiteen og CEMP før de blir innlemmet i studien.

Etterforskerne, representantene eller helsepersonell vil innhente skriftlige informerte samtykkeskjemaer fra hver pasient eller en juridisk representant før noen spesifikk aktivitet i studien utføres.