Chilensk magcancer-arbetsgrupp (FORCE 1) (FORCE-1)

Deltagande enheter: Chilean Gastric Cancer Task Force (GCTF) är en kollektiv insats mellan två huvudidentiteter: 1- Centre of Excellence of Precision Medicine (CEMP), som inrättades genom en gemensam finansiering av den statliga myndigheten för ekonomisk utveckling (Corporacion) de Fomento de la Produccion, CORFO) och Pfizer Chile och 2- Center UC for Investigation in Oncology (CITO) baserat vid Pontificia Universidad Católica de Chile. Båda enheterna är ideella forskningsorganisationer som syftar till att förbättra folkbildning och implementera strategier för att förbättra kliniska resultat inom onkologisk behandling och cancerprevention.

Primärt mål: Att stratifiera chilenska GC-patienter i prognostiska undergrupper och att korrelera terapisvar enligt kliniska, protein-, epigenetiska och genetiska förändringar i en kohort av 200 GAC-patienter.

Sekundära mål

• För att bestämma mutationsprofilen hos chilenska GC-patienter.
• Att bedöma andelen chilenska GC-patienter som kan dra nytta av för närvarande tillgängliga läkemedelsbara mål (handlingsbara gener).
• För att korrelera närvaron av EBV till kliniska parametrar.
• För att bedöma expressionsnivåerna av proteiner associerade med molekylära stratifieringar och för närvarande riktade terapier (t. PD-L1 och antiangiogenika)
• För att bestämma profilen för SNP i DPYD- och TYMS-generna hos chilenska GC-patienter och deras korrelation med biverkningar.

Studera design

Etikgodkännande GCTF är en icke-interventionell, kollaborativ, prospektiv icke-samtidig studie som försöker stratifiera GAC-patienter baserat på deras prognos och terapisvar. Studien kommer att strikt följa alla lagkrav, förordningar och allmänna principer som fastställts av internationella organ som reglerar etiskt beteende inom biomedicinsk forskning på mänskliga ämnen, i enlighet med god klinisk praxis och Helsingforsdeklarationen. GCTF-studieprotokollet har godkänts av universitetssjukhusets etiska kommitté (Pontificia Universidad Catolica de Chile, CEC MED UC godkännandenummer 16-046, resolution daterad 21 april 2016).

Patientrekrytering & egenskaper Diagnostiserade GC-patienter kommer att rekryteras från nätverket Red UC Christus i Santiago, Chile. Patientrekrytering och signering av informerade samtyckesformulär, underhåll och övervakning av patientjournaler, biologiskt material och provextraktioner kommer att hanteras av CITO.

Patient- och behandlingshistoria visar att förutom kirurgi och kemoterapi fick cirka 10 % av patienterna Trastuzumab (ERBB2 riktad terapi, även kallat Herceptin), ytterligare 10 % fick immunterapi inklusive pembrolizumab och Ipilimumab (checkpoint-hämmare). Slutligen fick cirka 5 % av patienterna antiangiogen terapi (bestående av VEGFR2 riktad terapi med Ramucirumab). Dessutom visade histologisk analys att cirka 50 % av patienterna klassificerades som tarmtyp, 30 % som diffusa och 20 % var antingen blandade eller obestämda.

Inklusionskriterier

• Vuxen man eller kvinna, ålder >18 år
• Diagnostiserats med magcancer (histologisk eller cytologisk)
• Gå på hälsocenter i nätverket Red UC Christus i minst 3 månader med klinisk uppföljning
• Kan läsa och tala spanska
• Villig och kan ge skriftligt informerat samtycke till studien som bör dateras och undertecknas vid tidpunkten för registreringen.

Exklusions kriterier

Patienter:

• Med små biopsiprover otillräckliga för analys.
• Vars journaler inte kan hämtas eller är otillgängliga.
• Utan undertecknat informerat samtycke.

Kliniska data Kliniska data från patienter kommer att erhållas av vårdgivare och föras in i en elektronisk elektronisk plattform. Proverna kommer att kodas och patientens identitet är endast känd för den behandlande läkaren. Kliniska variabler är indelade i sektioner: Allmän patientinformation, Cancerhistoria, Laboratoriestudier, Comorbidity (Charlson) Index, Kemoterapi, Effekt & Uppföljning och Toxicitet. Patientkemoterapi kommer att klassificeras efter: regim, antal cykler & behandlingstid och kemoterapidosintensitet under de första 6 månaderna. Kemoterapikurer som representerar den första linjens kemoterapi som ordineras till patienterna. Full kemoterapidosintensitet under de första 6 månaderna kommer att erhållas genom patientintervjuer och läggs in direkt i onlineplattformen. Slutligen, data om effekt & uppföljning och toxicitet som erhållits från patienter.

Huvudsakliga kliniska resultat Huvudresultat kommer att härledas från erhållna kliniska data, dessa inkluderar total överlevnad, progressionsfri och återfallsfri överlevnad.

Biologiska prover & Oncomine Comprehensive Assay Biologiskt material som erhållits vid Red UC Christus kommer att transporteras till CEMP i Santiago de Chile enligt standardiserade protokoll. Totalt 200 patienttumörprover kommer att erhållas från arkiverade Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) prover. Nukleinsyror kommer att extraheras med RecoverAll-kitet (Thermo Fisher Cat #AM1975) och analyseras med det kommersiellt tillgängliga Oncomine Comprehensive Assay-kitet. Denna analys analyserar samtidigt DNA och RNA från prover, vilket möjliggör bedömning av 73 gen-hotspots (baserat på DNA), 49 fokalkopiatalvariationer (CNVs, DNA-baserade), 26 fullständiga kodande sekvenser (för mutationer och CNV-förlust) och 22 genfusion drivrutiner (RNA). Noterbart är att 72 av dessa gener är läkemedelsmål. Genomisk rådata erhållen (.vcf och .pdf filer) kommer att lagras och säkerhetskopieras i ett lokalt datacenter för efterföljande genomisk analys. Efter publicering av resultaten av denna studie kommer Oncomine-resultaten tillsammans med klinisk klassificering av enskilda tumörer att göras allmänt tillgängliga.

Tissue Micro Array (TMA) Analys Följande gener kommer att analyseras ytterligare av en TMA med användning av specifika antikroppar mot: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat # B7-DC/CD273), Fosforylerad mTOR ( Abcam Cat # AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat # AB39256), Phosphoryated Akt (Thermo Cat # 473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 221606, Cat 5) Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) och fyra mikrosatellitmarkörer (alla från Roche): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5902999), #11MS 06419216001). Manuell TMA kommer att förberedas enligt tidigare beskrivning. Kortfattat kommer paraffinblock att erhållas och skäras och färgas med Hematoxylin & Eosin (H&E) för att välja det bästa histologiska området. Därefter kommer det valda vävnadsområdet att placeras i TMA:n genom att cirkla det identifierade området i motsvarande block. Cylindriska kärnbiopsier kommer att extraheras från varje paraffinblock med hjälp av en 1 mm stilett och placeras i ett nytt mottagarblock. Utvalda adekvata fall hade tumörer som upptog minst 10 % av kärnområdet. Varje fall kommer att behandlas i tre exemplar för att förhindra vävnadsförlust under skärning. Sektioner från varje vävnadsarrayblock kommer att skäras, avparaffineras och dehydreras för H&E och immunhistokemiska procedurer.

Genmetylering Promotorgenmetylering på sex utvalda gener som tidigare har visat promotorreglering genom metylering associerad med GC kommer att bedömas. Metyleringsanalys kommer att inkludera reprimogenen och andra mRNA associerade med GC-progression. Analys kommer att utföras genom bisulfitsekvensering som beskrivits tidigare med hjälp av EZ DNA methylation Gold kit (Zymo Research) med mindre modifieringar. I korthet amplifieras bisulfitbehandlat DNA med användning av specifika PCR-primrar, med PCR-produkter som därefter klonas och sekvenseras.

EBV-identifiering EBV-subtyper i patientprover kommer att bedömas med den kromogena in situ-hybridiseringsmetoden (CISH) med mindre modifieringar.

Analys av singelnukleotidpolymorfism (SNP) En betydande andel av GC-patienter kan utveckla allvarlig toxicitet från 5-FU-behandling inklusive benmärgssuppression, neuropati, lågt antal vita blodkroppar, feber, infektioner, illamående, kräkningar, svår diarré, mun och matsmältningsorgan. inflammation, som alla är registrerade i patienthistorien för andra kohorter. Subtila personliga förändringar och populationsförändringar i DNA, kallade SNPs, kan stå för ökningar av risken för 5-FU-toxicitet; 5-FU-metabolismen är till övervägande del lever, där enzymet DPYD är ansvarigt för att metabolisera >80 % av läkemedlet, vilket producerar den inaktiva metaboliten 5,6-dihydroxi-5-FU. Det är allmänt dokumenterat att en minskad DPYP-aktivitet är associerad med allvarlig toxicitet. Icke-metaboliserad fraktion av 5-FU (20%) omvandlas av en serie enzymer (t.ex. TP, TK), och producerar de aktiva metaboliter som kommer att orsaka TYMS-hämning, och därigenom främja DNA/RNA-skada. Variationer i TYMS- och MTHFR-gener (relaterade till minskad folatsyntes, ökad 5-FU-effekt) har associerats med toxicitet genom behandling med 5-FU. Tillvägagångssättet som användes för att välja ut de genetiska varianterna bestod av en sökning i databasen PharmGKB. Totalt sex icke-synonyma SNP:er kommer att analyseras: fyra av dem omfattar DPYD-genen, en för TYMS och en för MTHFR. Analys kommer att utföras med TaqMan™ SNP Genotyping Assay-teknologi (Applied Biosystems™). SNP:er kommer att bedömas i DNA isolerat från paraffininbäddade patientprover.

Provstorlek och statistisk analys

Minsta provantalet kommer att beräknas för att säkerställa att målen för projektet uppnås fullt ut. Med tanke på att ungefär 90 % av GC-fallen verkligen är GAC, vid 5 % felfrekvens och vid 95 % konfidensintervall förutsåg utredarna ursprungligen en urvalsstorlek på 200 patienter. Men utredarna har också övervägt en andel på 15 % av provförluster (defekta prover eller patientbortfall), vilket gav totalt 230 patienter att rekryteras.

Standard deskriptiv statistik kommer att användas för att analysera kvalitativa och kvantitativa variabler, såsom relativa och absoluta frekvenser, frekvenstabeller, medelvärde, median, standardavvikelse, intervall och kvartiler. En 95% konfidens kommer att anses lämplig för analys. Beskrivande statistik kommer också att användas för att karakterisera de mest relevanta uppmätta kliniska parametrarna. Associationen av kategoriserade variabler kommer att utföras med chi-kvadrat eller Fishers exakta test. Variansanalys i en arm kommer att jämföra kontinuerliga variabler mellan grupper. Studier av överlevnadsresultat kommer att utföras med hjälp av Kaplan-Meier-metoden. Prognostiska faktorer kommer att utvärderas enligt Cox proportional hazards regressionsmodell.

Principal komponentanalys (PCA) av genvarianterna kommer att genomföras och associeringen av de första huvudkomponenterna med en liten fördefinierad uppsättning genomiska förändringssignaturer kommer att bedömas. För att definiera molekylära undergrupper kommer utredarna att använda oövervakad klustring. Korrelationen av de molekylära subtyperna med kliniska data (t.ex. ålder, kön, Lauren-klass) och kliniska resultat (t.ex. total överlevnad, svarsfrekvens) kommer att bedömas. Dessutom kommer övervakad klassificering att utföras baserat på kliniska resultat och de resulterande grupperna för båda metoderna kommer att jämföras med andra rapporterade molekylära subtyper.

Patientskydd/skriftliga informerade samtyckesformulär

Alla parter garanterar skyddet av patienternas personliga journaler. Patientnamn ingår inte i någon form i arkrapporter, publikationer eller i någon typ av publicerbara dokument som härrör från studien med undantag för dokument som krävs enligt lag. Blanketter för informerat samtycke utarbetas strikt enligt lagliga och lokala bestämmelser. De skriftliga formulären för informerat samtycke, inklusive alla ändringar som gjorts under studien, måste godkännas prospektivt av Internal Review Board/oberoende etikkommitté och CEMP innan de införlivas i studien.

Utredarna, representanterna eller vårdgivare kommer att erhålla skriftliga informerade samtyckesformulär från varje patient eller en juridisk representant innan någon specifik aktivitet i studien utförs.