Chilská pracovní skupina pro rakovinu žaludku (FORCE 1) (FORCE-1)

Zúčastněné subjekty: Chilean Gatric Cancer Task Force (GCTF) je kolektivní úsilí mezi dvěma hlavními identitami: 1- Centrum excelence precizní medicíny (CEMP), které bylo založeno prostřednictvím společného financování vládní agenturou pro hospodářský rozvoj (Corporacion). de Fomento de la Produccion, CORFO) a Pfizer Chile a 2- The Center UC for Investigation in Oncology (CITO) se sídlem na Pontificia Universidad Católica de Chile. Oba subjekty jsou neziskovými výzkumnými organizacemi, jejichž cílem je zlepšit vzdělávání veřejnosti a implementovat strategie ke zlepšení klinických výsledků v onkologické léčbě a prevenci rakoviny.

Primární cíl: Stratifikovat chilské pacienty s GC do prognostických podskupin a korelovat léčebnou odpověď podle klinických, proteinových, epigenetických a genetických změn v kohortě 200 pacientů s GAC.

Sekundární cíle

• Stanovit mutační profil u chilských pacientů s GC.
• Posoudit procento chilských pacientů s GC, kteří by mohli mít prospěch z aktuálně dostupných cílů pro podávání léků (akční geny).
• Korelovat přítomnost EBV s klinickými parametry.
• K posouzení úrovní exprese proteinů spojených s molekulárními stratifikacemi a aktuálně cílenými terapiemi (např. PD-L1 a antiangiogenika)
• Stanovit profil SNP v genech DPYD a TYMS u chilských pacientů s GC a jejich korelaci s nežádoucími účinky.

Studovat design

Etické schválení GCTF je neintervenční, kolaborativní, prospektivní nesouběžná studie, která se snaží stratifikovat pacienty s GAC na základě jejich prognózy a odpovědi na léčbu. Studie bude přísně dodržovat všechny zákonné požadavky, předpisy a obecné zásady stanovené mezinárodními agenturami upravujícími etické chování v biomedicínském výzkumu na lidských subjektech v souladu se správnou klinickou praxí a Helsinskou deklarací. Protokol studie GCTF byl schválen Etickou komisí univerzitní nemocnice (Pontificia Universidad Catolica de Chile, schvalovací číslo CEC MED UC 16-046, usnesení ze dne 21. dubna 2016).

Nábor a charakteristiky pacientů Diagnostikovaní pacienti s GC budou rekrutováni ze sítě Red UC Christus v Santiagu v Chile. Nábor pacientů a podepisování formulářů informovaného souhlasu, vedení a sledování zdravotních záznamů pacientů, biologického materiálu a odběry vzorků bude řídit CITO.

Anamnéza pacientů a léčby ukazuje, že kromě chirurgického zákroku a chemoterapie bylo přibližně 10 % pacientů léčeno trastuzumabem (ERBB2 cílená terapie, nazývaná také Herceptin), dalších 10 % dostávalo imunoterapii zahrnující pembrolizumab a Ipilimumab (inhibitory kontrolních bodů). Nakonec přibližně 5 % pacientů dostalo antiangiogenní terapii (skládající se z VEGFR2 cílené terapie ramucirumabem). Histologická analýza navíc ukázala, že přibližně 50 % pacientů bylo klasifikováno jako střevní typ, 30 % jako difuzní a 20 % bylo buď smíšených nebo neurčitých.

Kritéria pro zařazení

• Dospělý muž nebo žena ve věku >18 let
• Diagnostikována rakovina žaludku (histologická nebo cytologická)
• Návštěva zdravotních středisek sítě Red UC Christus po dobu nejméně 3 měsíců s klinickým sledováním
• Schopný číst a mluvit španělsky
• Ochotný a schopný poskytnout písemný informovaný souhlas se studií, který by měl být datován a podepsán v době zápisu.

Kritéria vyloučení

Pacienti:

• S malými bioptickými vzorky nedostačujícími pro analýzu.
• jejichž lékařské záznamy nelze shromáždit nebo jsou nedostupné.
• Bez podepsaného informovaného souhlasu.

Klinická data Klinická data od pacientů budou získávána poskytovateli zdravotní péče a vložena do online elektronické platformy. Vzorky budou kódovány a totožnost pacienta známa pouze ošetřujícímu lékaři. Klinické proměnné jsou rozděleny do sekcí: Všeobecné informace o pacientovi, Anamnéza rakoviny, Laboratorní studie, Komorbidní (Charlsonův) index, Chemoterapie, Účinnost a sledování a Toxicita. Chemoterapie pacienta bude klasifikována podle: režimu, počtu cyklů a doby léčby a intenzity dávky chemoterapie během prvních 6 měsíců. Chemoterapeutické režimy představující chemoterapii první linie předepisovanou pacientům. Úplná intenzita dávky chemoterapie během prvních 6 měsíců bude získána prostřednictvím rozhovorů s pacienty a vložena přímo do online platformy. Konečně údaje o účinnosti, sledování a toxicitě získané od pacientů.

Hlavní klinické výsledky Hlavní výsledky budou odvozeny ze získaných klinických údajů, mezi ně patří celkové přežití, míra přežití bez progrese a bez recidivy.

Biologické vzorky & Oncomine Comprehensive Assay Biologické materiály získané v Red UC Christus budou přepraveny do CEMP v Santiagu de Chile podle standardizovaných protokolů. Celkem 200 vzorků nádorů pacientů bude získáno z archivovaných vzorků zalitých ve formalínu fixovaném do parafínu (FFPE). Nukleové kyseliny budou extrahovány pomocí soupravy RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) a analyzovány pomocí komerčně dostupné soupravy Oncomine Comprehensive Assay. Tento test současně analyzuje DNA a RNA ze vzorků, což umožňuje posouzení 73 genových hotspotů (na základě DNA), 49 variací počtu fokálních kopií (CNV, založené na DNA), 26 úplných kódujících sekvencí (pro mutace a ztrátu CNV) a 22 genových fúzí. řidiči (RNA). Je pozoruhodné, že 72 z těchto genů jsou cíle pro léky. Získaná nezpracovaná genomická data (.vcf a .pdf soubory) budou uloženy a zálohovány v místním datovém centru pro následnou genomickou analýzu. Po zveřejnění výsledků této studie budou výsledky Oncomine spolu s klinickou klasifikací jednotlivých nádorů veřejně dostupné.

Analýza tkáňového mikročipu (TMA) Následující geny budou dále analyzovány TMA pomocí specifických protilátek proti: PD-L1 (Dako, kat. č. SK00521), PD-L2 (termo kat. č. B7-DC/CD273), fosforylovaný mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat #AB39256), Fosforylovaný Akt (Thermo Cat #473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), P16 (Roche, Cat # 05278368001), P16 (Roche, Cat # Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) a čtyři mikrosatelitní markery (vše od Roche): MLH1 (Kat # 06472966001), MSH2 (Kat # 05269270001), MSH6 (Kat # 110929), Cat 06419216001). Manuální TMA bude připraven tak, jak bylo popsáno výše. Stručně řečeno, parafínové bloky budou získány a nařezány a obarveny pomocí Hematoxylin & Eosin (H&E), aby se vybrala nejlepší histologická oblast. Následně bude vybraná oblast tkáně umístěna do TMA kroužením identifikované oblasti v odpovídajícím bloku. Cylindrické biopsie jádra budou extrahovány z každého parafínového bloku pomocí 1 mm styletu a umístěny do nového recipientního bloku. Vybrané adekvátní případy měly nádory, které zabíraly alespoň 10 % plochy jádra. Každý případ bude zpracován trojmo, aby se zabránilo ztrátě tkáně během řezání. Řezy z každého bloku tkáňového pole budou nařezány, zbaveny parafinu a dehydratovány pro H&E a imunohistochemické postupy.

Metylace genu Bude hodnocena methylace promotorového genu na šesti vybraných genech, které dříve vykazovaly regulaci promotoru methylací spojenou s GC. Methylační analýza bude zahrnovat reprimo gen a další mRNA spojené s progresí GC. Analýza bude provedena bisulfitovým sekvenováním, jak bylo popsáno dříve, s použitím sady EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) s menšími úpravami. Stručně, bisulfitově upravená DNA je amplifikována pomocí specifických PCR primerů, přičemž PCR produkty jsou následně klonovány a sekvenovány.

Identifikace EBV Subtypy EBV ve vzorcích pacientů budou hodnoceny pomocí metody chromogenní in situ hybridizace (CISH) s drobnými úpravami.

Analýza jednonukleotidového polymorfismu (SNP) U významné části pacientů s GC se může při léčbě 5-FU vyvinout závažná toxicita včetně suprese kostní dřeně, neuropatie, nízkého počtu bílých krvinek, horečky, infekcí, nevolnosti, zvracení, těžkého průjmu, úst a zažívacího traktu záněty, které jsou všechny zaznamenány v anamnéze pacientů jiných kohort. Jemné osobní a populační změny v DNA, nazývané SNP, mohou odpovídat za zvýšení rizika toxicity 5-FU; Metabolismus 5-FU probíhá převážně v játrech, kde enzym DPYD je odpovědný za metabolizaci > 80 % léčiva za vzniku neaktivního metabolitu 5,6 dihydroxy-5-FU. Je široce zdokumentováno, že snížená aktivita DPYP je spojena se závažnou toxicitou. Nemetabolizovaná frakce 5-FU (20 %) je transformována řadou enzymů (např. TP, TK), produkujících aktivní metabolity, které způsobí inhibici TYMS, a tím podpoří poškození DNA/RNA. Variace v genech TYMS a MTHFR (související se sníženou syntézou folátu, zvýšeným účinkem 5-FU) byly spojeny s toxicitou při léčbě 5-FU. Přístup, který byl použit k výběru genetických variant, sestával z vyhledávání v databázi PharmGKB. Bude analyzováno celkem šest nesynonymních SNP: čtyři z nich obsahují gen DPYD, jeden pro TYMS a jeden pro MTHFR. Analýza bude provedena pomocí technologie TaqMan™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems™). SNP budou hodnoceny v DNA izolované ze vzorků pacientů zalitých v parafínu.

Velikost vzorku a statistická analýza

Minimální počet vzorků bude vypočítán tak, aby bylo zajištěno úplné splnění cílů projektu. Vzhledem k tomu, že přibližně 90 % případů GC je skutečně GAC, při 5% chybovosti a 95% intervalu spolehlivosti vyšetřovatelé původně předpokládali velikost vzorku 200 pacientů. Vyšetřovatelé však také zvažovali 15% míru ztráty vzorků (vadné vzorky nebo vyřazení pacientů), což umožnilo získat celkem 230 pacientů.

Standardní popisná statistika bude využita k analýze kvalitativních a kvantitativních proměnných, jako jsou relativní a absolutní četnosti, frekvenční tabulky, průměr, medián, směrodatná odchylka, rozsah a kvartily. 95% spolehlivost bude považována za vhodnou pro analýzu. K charakterizaci nejdůležitějších měřených klinických parametrů bude také použita deskriptivní statistika. Asociace kategorizovaných proměnných bude provedena pomocí chí-kvadrát nebo Fisherových exaktních testů. Jednoramenná analýza rozptylu porovná spojité proměnné mezi skupinami. Studie výsledků přežití budou provedeny pomocí Kaplan-Meierovy metody. Prognostické faktory budou hodnoceny podle Coxova regresního modelu proporcionálních rizik.

Bude provedena analýza hlavních komponent (PCA) variant genů a bude hodnocena asociace prvních hlavních komponent s malým předdefinovaným souborem signatur genomových změn. K definování molekulárních podskupin použijí výzkumníci neřízené shlukování. Korelace molekulárních podtypů s klinickými údaji (např. věk, pohlaví, třída Lauren) a klinické výsledky (např. bude hodnoceno celkové přežití, míra odpovědi). Navíc bude provedena supervizovaná klasifikace na základě klinických výsledků a výsledné skupiny obou přístupů budou porovnány s ostatními hlášenými molekulárními subtypy.

Ochrana pacienta / písemné formuláře informovaného souhlasu

Všechny strany garantují ochranu osobních záznamů pacientů. Jména pacientů nejsou v žádné formě obsažena ve zprávách, publikacích ani v jakémkoli typu publikovatelného dokumentu odvozeného ze studie, s výjimkou dokumentů vyžadovaných zákonem. Formuláře informovaného souhlasu jsou vypracovány přísně podle právních a místních předpisů. Písemné formuláře informovaného souhlasu, včetně všech změn provedených v průběhu studie, musí být před začleněním do studie prospektivně schváleny výborem pro interní kontrolu/nezávislou etickou komisí a CEMP.

Zkoušející, zástupci nebo poskytovatelé zdravotní péče získají písemný informovaný souhlas od každého pacienta nebo právního zástupce před provedením jakékoli konkrétní aktivity studie.