Chilenische Task Force für Magenkrebs (FORCE 1) (FORCE-1)

Beteiligte Einrichtungen: Die chilenische Magenkrebs-Task Force (GCTF) ist eine kollektive Anstrengung zweier Hauptidentitäten: 1- Das Exzellenzzentrum für Präzisionsmedizin (CEMP), das durch eine gemeinsame Finanzierung durch die Regierungsagentur für wirtschaftliche Entwicklung (Corporacion de Fomento de la Produccion, CORFO) und Pfizer Chile und 2- The Centre UC for Investigation in Oncology (CITO) mit Sitz an der Pontificia Universidad Católica de Chile. Beide Einheiten sind gemeinnützige Forschungsorganisationen, die darauf abzielen, die öffentliche Bildung zu verbessern und Strategien zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse in der onkologischen Behandlung und Krebsprävention umzusetzen.

Primäres Ziel: Stratifizierung chilenischer GC-Patienten in prognostische Untergruppen und Korrelation des Therapieansprechens gemäß klinischen, proteinbedingten, epigenetischen und genetischen Veränderungen in einer Kohorte von 200 GAC-Patienten.

Sekundäre Ziele

• Bestimmung des Mutationsprofils bei chilenischen GC-Patienten.
• Bewertung des Prozentsatzes chilenischer GC-Patienten, die von derzeit verfügbaren medikamentösen Zielen (umsetzbare Gene) profitieren könnten.
• Korrelieren des Vorhandenseins von EBV mit klinischen Parametern.
• Um die Expressionsniveaus von Proteinen zu bewerten, die mit molekularen Stratifikationen und derzeit zielgerichteten Therapien (z. PD-L1 und Antiangiogene)
• Bestimmung des Profils von SNPs in den DPYD- und TYMS-Genen bei chilenischen GC-Patienten und ihrer Korrelation mit unerwünschten Ereignissen.

Studiendesign

Ethikgenehmigung Die GCTF ist eine nicht-interventionelle, kooperative, prospektive, nicht gleichzeitige Studie, die versucht, GAC-Patienten basierend auf ihrer Prognose und ihrem Therapieansprechen zu stratifizieren. Die Studie wird sich strikt an alle gesetzlichen Anforderungen, Vorschriften und allgemeinen Grundsätze halten, die von internationalen Organisationen aufgestellt wurden, die das ethische Verhalten in der biomedizinischen Forschung am Menschen regeln, gemäß den guten klinischen Praktiken und der Deklaration von Helsinki. Das GCTF-Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums (Pontificia Universidad Catolica de Chile, CEC MED UC-Zulassungsnummer 16-046, Beschluss vom 21. April 2016) genehmigt.

Patientenrekrutierung und Merkmale Diagnostizierte GC-Patienten werden aus dem Red UC Christus-Netzwerk in Santiago, Chile, rekrutiert. Die Patientenrekrutierung und Unterzeichnung von Einverständniserklärungen, Pflege und Überwachung der Patientenakten, des biologischen Materials und der Probenentnahmen werden von CITO verwaltet.

Die Patienten- und Behandlungsanamnese zeigt, dass neben Operation und Chemotherapie etwa 10 % der Patienten Trastuzumab (zielgerichtete ERBB2-Therapie, auch Herceptin genannt) und weitere 10 % eine Immuntherapie einschließlich Pembrolizumab und Ipilimumab (Checkpoint-Inhibitoren) erhielten. Schließlich erhielten etwa 5 % der Patienten eine antiangiogene Therapie (bestehend aus einer zielgerichteten VEGFR2-Therapie mit Ramucirumab). Darüber hinaus zeigte die histologische Analyse, dass etwa 50 % der Patienten als Darmtyp klassifiziert wurden, 30 % als diffus und 20 % entweder gemischt oder unbestimmt.

Einschlusskriterien

• Erwachsener Mann oder Frau im Alter von >18 Jahren
• Magenkrebs diagnostiziert (histologisch oder zytologisch)
• Besuch von Gesundheitszentren des Netzwerks Red UC Christus für mindestens 3 Monate mit klinischer Nachsorge
• Kann Spanisch lesen und sprechen
• Bereit und in der Lage, eine schriftliche Einverständniserklärung zur Studie abzugeben, die zum Zeitpunkt der Registrierung datiert und unterzeichnet werden sollte.

Ausschlusskriterien

Patienten:

• Bei kleinen Biopsieproben, die für die Analyse nicht ausreichen.
• Deren Krankenakten nicht gesammelt werden können oder nicht verfügbar sind.
• Ohne unterschriebene Einverständniserklärung.

Klinische Daten Klinische Daten von Patienten werden von Gesundheitsdienstleistern erhoben und in eine elektronische Online-Plattform eingegeben. Die Proben werden kodiert und die Patientenidentität ist nur dem behandelnden Arzt bekannt. Klinische Variablen sind in Abschnitte unterteilt: Allgemeine Patienteninformationen, Krebsanamnese, Laborstudien, Komorbiditätsindex (Charlson), Chemotherapie, Wirksamkeit und Nachsorge und Toxizität. Die Chemotherapie des Patienten wird klassifiziert nach: Regime, Anzahl der Zyklen und Behandlungsdauer und Dosisintensität der Chemotherapie während der ersten 6 Monate. Chemotherapieschemata, die die Erstlinien-Chemotherapie darstellen, die den Patienten verschrieben wird. Die volle Chemotherapie-Dosisintensität während der ersten 6 Monate wird durch Patienteninterviews ermittelt und direkt in die Online-Plattform eingegeben. Schließlich Daten zur Wirksamkeit, Nachsorge und Toxizität von Patienten.

Wichtigste klinische Endpunkte Die wichtigsten klinischen Endpunkte werden aus den erhaltenen klinischen Daten abgeleitet, darunter das Gesamtüberleben, die Raten für das progressionsfreie und das rezidivfreie Überleben.

Biologische Proben & Oncomine Comprehensive Assay Biologische Materialien, die an der Red UC Christus gewonnen wurden, werden nach standardisierten Protokollen zum CEMP in Santiago de Chile transportiert. Insgesamt 200 Tumorproben von Patienten werden aus archivierten Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben gewonnen. Nukleinsäuren werden mit dem RecoverAll-Kit (Thermo Fisher Kat.-Nr. AM1975) extrahiert und mit dem im Handel erhältlichen Oncomine Comprehensive Assay-Kit analysiert. Dieser Assay analysiert gleichzeitig DNA und RNA aus Proben, was die Bewertung von 73 Gen-Hotspots (basierend auf DNA), 49 Variationen der fokalen Kopienzahl (CNVs, DNA-basiert), 26 vollständige codierende Sequenzen (für Mutationen und CNV-Verlust) und 22 Genfusionen ermöglicht Treiber (RNA). Bemerkenswerterweise sind 72 dieser Gene Arzneimittelziele. Erhaltene genomische Rohdaten (.vcf und .pdf Dateien) werden in einem lokalen Datenzentrum für die spätere Genomanalyse gespeichert und gesichert. Nach der Veröffentlichung der Ergebnisse dieser Studie werden die Oncomine-Ergebnisse zusammen mit der klinischen Klassifizierung einzelner Tumore öffentlich zugänglich gemacht.

Tissue Micro Array (TMA)-Analyse Die folgenden Gene werden von einem TMA unter Verwendung spezifischer Antikörper weiter analysiert gegen: PD-L1 (Dako, Kat.-Nr. SK00521), PD-L2 (Thermo Kat.-Nr. B7-DC/CD273), phosphoryliertes mTOR ( Abcam-Kat.-Nr. AB118815), S. 53 (Kat.-Nr. 5278074001), VEGFR2 (Abcam-Kat.-Nr. AB39256), Phosphorylated Akt (Thermo-Kat.-Nr. 473), HER2 (Roche, Kat.-Nr. 05278368001), S. 16 (Roche, Kat.-Nr. 06695221001), Met ( Abcam Kat. Nr. AB51067), HA-4 (Abcam Kat Nr. AB24480) und vier Mikrosatellitenmarker (alle von Roche): MLH1 (Kat Nr. 06472966001), MSH2 (Kat Nr. 05269270001), MSH6 (Kat Nr. 5929911001), PMS2 (Kat Nr. 06419216001). Die manuelle TMA wird wie zuvor beschrieben vorbereitet. Kurz gesagt werden Paraffinblöcke erhalten und geschnitten und mit Hämatoxylin & Eosin (H&E) gefärbt, um den besten histologischen Bereich auszuwählen. Anschließend wird der ausgewählte Gewebebereich in der TMA platziert, indem der identifizierte Bereich im entsprechenden Block eingekreist wird. Zylindrische Kernbiopsien werden aus jedem Paraffinblock mit einem 1-mm-Stilett entnommen und in einen neuen Empfängerblock platziert. Ausgewählte adäquate Fälle hatten Tumore, die mindestens 10 % des Kernbereichs einnahmen. Jeder Fall wird in dreifacher Ausfertigung verarbeitet, um Gewebeverlust während des Schneidens zu vermeiden. Schnitte aus jedem Tissue-Array-Block werden für H&E- und immunhistochemische Verfahren geschnitten, entparaffiniert und dehydriert.

Genmethylierung Die Promotorgenmethylierung an sechs ausgewählten Genen, die zuvor eine Promotorregulation durch Methylierung im Zusammenhang mit GC gezeigt haben, wird bewertet. Die Methylierungsanalyse umfasst das Reprimo-Gen und andere mRNAs, die mit der GC-Progression assoziiert sind. Die Analyse wird durch Bisulfit-Sequenzierung wie zuvor beschrieben unter Verwendung des EZ DNA Methylation Gold-Kits (Zymo Research) mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, Bisulfit-behandelte DNA wird unter Verwendung spezifischer PCR-Primer amplifiziert, wobei PCR-Produkte anschließend kloniert und sequenziert werden.

EBV-Identifizierung EBV-Subtypen in Patientenproben werden unter Verwendung der chromogenen In-situ-Hybridisierungsmethode (CISH) mit geringfügigen Modifikationen bewertet.

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-Analyse Ein erheblicher Teil der GC-Patienten kann durch die 5-FU-Behandlung schwere Toxizität entwickeln, einschließlich Knochenmarksuppression, Neuropathie, niedrige Anzahl weißer Blutkörperchen, Fieber, Infektionen, Übelkeit, Erbrechen, schwerer Durchfall, Mund und Verdauungstrakt Entzündung, die alle in der Krankengeschichte anderer Kohorten verzeichnet sind. Subtile persönliche und Populationsveränderungen in der DNA, sogenannte SNPs, können für ein erhöhtes Risiko einer 5-FU-Toxizität verantwortlich sein; Der 5-FU-Metabolismus findet überwiegend in der Leber statt, wo das Enzym DPYD für die Metabolisierung von >80 % des Arzneimittels verantwortlich ist und den inaktiven Metaboliten 5,6-Dihydroxy-5-FU produziert. Es ist umfassend dokumentiert, dass eine verringerte DPYP-Aktivität mit schwerer Toxizität verbunden ist. Die nicht metabolisierte Fraktion von 5-FU (20 %) wird durch eine Reihe von Enzymen (z. B. TP, TK) umgewandelt, wodurch die aktiven Metaboliten produziert werden, die eine TYMS-Hemmung verursachen und dadurch DNA/RNA-Schäden fördern. Variationen in den TYMS- und MTHFR-Genen (im Zusammenhang mit reduzierter Folatsynthese, erhöhter 5-FU-Wirkung) wurden mit Toxizität durch die Behandlung mit 5-FU in Verbindung gebracht. Der Ansatz zur Auswahl der genetischen Varianten bestand aus einer Suche in der Datenbank PharmGKB. Insgesamt werden sechs nicht-synonyme SNPs analysiert: vier davon umfassen das DPYD-Gen, eines für TYMS und eines für MTHFR. Die Analyse wird unter Verwendung der TaqMan™ SNP Genotyping Assay-Technologie (Applied Biosystems™) durchgeführt. SNPs werden in DNA bewertet, die aus in Paraffin eingebetteten Patientenproben isoliert wurde.

Stichprobengröße und statistische Analyse

Die Mindestprobenanzahl wird berechnet, um sicherzustellen, dass die Ziele des Projekts vollständig erreicht werden. In Anbetracht der Tatsache, dass ungefähr 90 % der GC-Fälle tatsächlich GAC sind, prognostizierten die Forscher bei einer Fehlerrate von 5 % und einem Konfidenzintervall von 95 % ursprünglich eine Stichprobengröße von 200 Patienten. Die Forscher haben jedoch auch eine Probenverlustrate von 15 % (defekte Proben oder Patientenabbruch) berücksichtigt, wodurch insgesamt 230 Patienten rekrutiert werden mussten.

Standarddeskriptive Statistiken werden verwendet, um qualitative und quantitative Variablen zu analysieren, wie z. B. relative und absolute Häufigkeiten, Häufigkeitstabellen, Durchschnitt, Median, Standardabweichung, Bereich und Quartile. Eine Konfidenz von 95 % wird als angemessen für die Analyse betrachtet. Beschreibende Statistiken werden auch verwendet, um die relevantesten gemessenen klinischen Parameter zu charakterisieren. Die Zuordnung kategorisierter Variablen erfolgt durch Chi-Quadrat- oder exakte Fisher-Tests. Die einarmige Varianzanalyse vergleicht kontinuierliche Variablen zwischen Gruppen. Überlebensergebnisstudien werden unter Verwendung der Kaplan-Meier-Methode durchgeführt. Prognosefaktoren werden nach dem Proportional-Hazards-Regressionsmodell von Cox bewertet.

Es wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Genvarianten durchgeführt und die Assoziation der ersten Hauptkomponenten mit einem kleinen vordefinierten Satz von Genomveränderungssignaturen wird bewertet. Um molekulare Untergruppen zu definieren, verwenden die Forscher unüberwachtes Clustering. Die Korrelation der molekularen Subtypen mit klinischen Daten (z. Alter, Geschlecht, Lauren-Klasse) und klinische Ergebnisse (z. Gesamtüberleben, Ansprechrate) beurteilt werden. Darüber hinaus wird eine überwachte Klassifizierung basierend auf klinischen Ergebnissen durchgeführt und die resultierenden Gruppen beider Ansätze werden mit anderen berichteten molekularen Subtypen verglichen.

Patientenschutz/schriftliche Einverständniserklärungen

Alle Parteien garantieren den Schutz der persönlichen Daten der Patienten. Patientennamen werden in keiner Form in Blattberichten, Veröffentlichungen oder in irgendeiner Art von aus der Studie abgeleiteten veröffentlichungsfähigen Dokumenten mit Ausnahme von gesetzlich vorgeschriebenen Dokumenten aufgenommen. Einverständniserklärungen werden streng nach gesetzlichen und lokalen Vorschriften ausgearbeitet. Die schriftlichen Einverständniserklärungen, einschließlich aller während der Studie vorgenommenen Änderungen, müssen prospektiv vom Internal Review Board/unabhängigen Ethikkomitee und CEMP genehmigt werden, bevor sie in die Studie aufgenommen werden.

Die Prüfärzte, Vertreter oder Gesundheitsdienstleister holen von jedem Patienten oder einem gesetzlichen Vertreter eine schriftliche Einverständniserklärung ein, bevor eine bestimmte Aktivität der Studie durchgeführt wird.