Chilei gyomorrák elleni munkacsoport (FORCE 1) (FORCE-1)

Résztvevő entitások: A Chilei Gyomorrák Munkacsoport (GCTF) két fő identitás közös erőfeszítése: 1- A Precíziós Orvostudományi Kiválósági Központ (CEMP), amelyet a gazdasági fejlesztésért felelős kormányhivatal (Corporacion) közös finanszírozása révén hoztak létre. de Fomento de la Produccion, CORFO) és a Pfizer Chile, valamint a 2- The Center UC for Investigation in Oncology (CITO), amelynek székhelye a Pontificia Universidad Católica de Chile. Mindkét entitás non-profit kutatószervezet, amelynek célja a közoktatás javítása, valamint az onkológiai kezelés és a rákmegelőzés klinikai eredményeinek javítását célzó stratégiák végrehajtása.

Elsődleges cél: A chilei GC-betegek prognosztikai alcsoportokba sorolása, és a terápiás válasz korrelációja a klinikai, fehérje-, epigenetikai és genetikai változások szerint 200 GAC-betegből álló kohorszban.

Másodlagos célok

• Chilei GC-betegek mutációs profiljának meghatározása.
• Annak felmérése, hogy a chilei GC-betegek hány százaléka profitálhat a jelenleg rendelkezésre álló, gyógyszeres célpontokból (működő génekből).
• Az EBV jelenlétének összefüggésbe hozása klinikai paraméterekkel.
• A molekuláris rétegződésekkel és a jelenleg célzott terápiákkal (pl. PD-L1 és antiangiogén szerek)
• Az SNP-k profiljának meghatározása a DPYD és TYMS génekben chilei GC-betegekben, valamint összefüggésük a nemkívánatos eseményekkel.

Dizájnt tanulni

Etikai jóváhagyás A GCTF egy nem intervenciós, együttműködésen alapuló, prospektív, nem egyidejű vizsgálat, amely a GAC-betegek rétegzésére törekszik a prognózis és a terápiás válasz alapján. A tanulmány szigorúan betart minden olyan jogi követelményt, előírást és általános alapelvet, amelyet a nemzetközi ügynökségek határoztak meg az emberi alanyokon végzett orvosbiológiai kutatások etikai magatartására vonatkozóan, követve a helyes klinikai gyakorlatot és Helsinki nyilatkozatát. A GCTF vizsgálati protokollt az egyetemi kórház etikai bizottsága hagyta jóvá (Pontificia Universidad Catolica de Chile, CEC MED UC 16-046 jóváhagyási szám, 2016. április 21-i határozat).

Beteg toborzás és jellemzők A diagnosztizált GC-betegeket a Red UC Christus hálózatból, a chilei Santiago-ból veszik fel. A betegek toborzását és a tájékozott beleegyező nyilatkozatok aláírását, a betegek egészségügyi dokumentációjának, a biológiai anyagok és a minták kinyerésének karbantartását és figyelemmel kísérését a CITO végzi.

A betegek és a kezelési előzmények azt mutatják, hogy a műtét és a kemoterápia mellett a betegek körülbelül 10%-a kapott Trastuzumabot (ERBB2 célzott terápia, más néven Herceptin), további 10%-uk kapott immunterápiát, beleértve a pembrolizumabot és az ipilimumabot (ellenőrzőpont-gátlók). Végül a betegek körülbelül 5%-a kapott antiangiogén terápiát (amely VEGFR2 célzott ramucirumab terápiából állt). Ezenkívül a szövettani elemzés azt mutatta, hogy a betegek körülbelül 50%-a béltípusba, 30%-a diffúz, 20%-a pedig vegyes vagy meghatározatlan volt.

Bevételi kritériumok

• Felnőtt férfi vagy nő, 18 év feletti
• Diagnosztizált gyomorrák (szövettani vagy citológiai)
• A Red UC Christus hálózat egészségügyi központjaiban való részvétel legalább 3 hónapig klinikai követéssel
• Képes olvasni és beszélni spanyolul
• Hajlandó és képes írásos beleegyező nyilatkozatot adni a vizsgálathoz, amelyet dátummal és aláírással kell ellátni a beiratkozáskor.

Kizárási kritériumok

Betegek:

• Kis biopsziás mintákkal, amelyek nem elegendőek az elemzéshez.
• Akinek az egészségügyi dokumentációja nem gyűjthető, vagy nem elérhető.
• Aláírt, tájékozott beleegyezés nélkül.

Klinikai adatok A betegek klinikai adatait az egészségügyi szolgáltatók szerzik be, és egy online elektronikus platformra viszik be. A mintákat kódolják, és a páciens személyazonosságát csak a kezelőorvos ismeri. A klinikai változók szakaszokra oszlanak: Általános beteginformáció, Ráktörténet, Laboratóriumi vizsgálatok, Komorbiditási (Charlson) Index, Kemoterápia, Hatékonyság és nyomon követés és Toxicitás. A betegek kemoterápiáját a következők szerint osztályozzák: kezelési rend, ciklusok száma és a kezelés ideje, valamint a kemoterápia dózisintenzitása az első 6 hónapban. A betegeknek felírt első vonalbeli kemoterápiát képviselő kemoterápiás sémák. A teljes kemoterápiás dózis intenzitása az első 6 hónapban páciensinterjúkon keresztül történik, és közvetlenül az online platformra kerül. Végül a betegektől származó hatékonysági és nyomon követési és toxicitási adatok.

Főbb klinikai eredmények A főbb eredményekre a kapott klinikai adatokból lehet következtetni, ezek közé tartozik a teljes túlélés, a progressziómentes és a kiújulásmentes túlélési arány.

Biológiai minták és átfogó oncomine vizsgálat A Red UC Christus-ban szerzett biológiai anyagokat szabványosított protokollok szerint szállítják a Santiago de Chile-i CEMP-be. Összesen 200 páciens daganatmintáját nyerik az archivált formalin fix paraffinba ágyazott (FFPE) mintákból. A nukleinsavakat a RecoverAll készlettel (Thermo Fisher Cat #AM1975) extraháljuk, és a kereskedelemben kapható Oncomine Comprehensive Assay készlettel elemezzük. Ez a vizsgálat egyidejűleg elemzi a mintákból származó DNS-t és RNS-t, lehetővé téve 73 génhotspot (DNS alapján), 49 fokális kópiaszám-variáció (CNV-k, DNS-alapú), 26 teljes kódoló szekvencia (mutációk és CNV-vesztés szempontjából) és 22 génfúzió értékelését. driverek (RNS). Ezek közül a gének közül 72 gyógyszer célpont. Gyári nyers genomi adatok (.vcf és .pdf fájlokat) egy helyi adatközpontban tárolják, és biztonsági másolatot készítenek a későbbi genomi elemzéshez. A tanulmány eredményeinek közzétételét követően az Oncomine eredményeit az egyes daganatok klinikai osztályozásával együtt nyilvánosan hozzáférhetővé teszik.

Tissue Micro Array (TMA) elemzése A következő géneket tovább elemzi egy TMA, specifikus antitestek felhasználásával: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat# B7-DC/CD273), foszforilált mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat # AB39256), foszforilált Akt (Thermo Cat # 473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 1), Met0 (26, Cat 5), Met0 2 Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) és négy mikroműhold marker (mind a Roche-tól): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 10001), MSH6 (Cat # 1001 (Cat) 06419216001). A kézi TMA a korábban leírtak szerint készül. Röviden: paraffin blokkokat nyerünk, vágunk és festünk Hematoxylin & Eosin (H&E) segítségével a legjobb szövettani terület kiválasztása érdekében. Ezt követően a kiválasztott szövetterület a TMA-ba kerül az azonosított terület bekarikázásával a megfelelő blokkban. Minden paraffinblokkból 1 mm-es mandzsettával hengeres magbiopsziát vonnak ki, és egy új recipiens blokkba helyezik. A kiválasztott megfelelő esetekben olyan daganatok voltak, amelyek a magterület legalább 10%-át elfoglalták. Minden esetet három példányban dolgozunk fel, hogy megakadályozzuk a vágás során a szövetveszteséget. Az egyes szövettömbök metszeteit levágják, paraffinmentesítik és dehidratálják a H&E és immunhisztokémiai eljárásokhoz.

Génmetiláció A promóter gén metilációját hat kiválasztott génen értékeljük, amelyek korábban a GC-hez kapcsolódó metilációval szabályozottak. A metilációs elemzés magában foglalja a reprimo gént és a GC progressziójával kapcsolatos egyéb mRNS-eket. Az analízist biszulfit szekvenálással hajtjuk végre a korábban leírtak szerint, az EZ DNS metilációs Gold kit (Zymo Research) használatával, kisebb módosításokkal. Röviden, a biszulfittal kezelt DNS-t specifikus PCR-láncindítók segítségével amplifikáljuk, majd a PCR-termékeket klónozzuk és szekvenáljuk.

Az EBV azonosítása A betegminták EBV-altípusait a kromogén in situ hibridizációs (CISH) módszerrel kell értékelni, kisebb módosításokkal.

Egy nukleotid polimorfizmus (SNP) elemzése A GC-betegek jelentős részénél súlyos toxicitás alakulhat ki az 5-FU-kezelés hatására, beleértve a csontvelő-szuppressziót, neuropátiát, alacsony fehérvérsejtszámot, lázat, fertőzéseket, hányingert, hányást, súlyos hasmenést, szájüregi és emésztőrendszeri tüneteket. gyulladás, amelyek mindegyike más kohorszok betegtörténetében is szerepel. A DNS-ben bekövetkező finom személyi és populációs változások, az úgynevezett SNP-k, az 5-FU toxicitás kockázatának növekedéséhez vezethetnek; Az 5-FU metabolizmus túlnyomórészt a májban zajlik, ahol a DPYD enzim felelős a gyógyszer >80%-ának metabolizmusáért, inaktív metabolitot, az 5,6-dihidroxi-5-FU-t termelve. Széles körben dokumentálták, hogy a csökkent DPYP aktivitás súlyos toxicitással jár. Az 5-FU nem metabolizált frakcióját (20%) egy sor enzim (például TP, TK) transzformálja, és olyan aktív metabolitokat termel, amelyek TYMS-gátlást okoznak, ezáltal elősegítik a DNS/RNS károsodását. A TYMS és MTHFR gének eltéréseit (a folsavszintézis csökkenésével, fokozott 5-FU-hatással összefüggésben) összefüggésbe hozták az 5-FU-kezelés toxicitásával. A genetikai változatok kiválasztásához használt megközelítés a PharmGKB adatbázisban való keresésből állt. Összesen hat nem szinonim SNP-t elemeznek: ezek közül négy a DPYD gént, egy a TYMS és egy az MTHFR gént tartalmazza. Az elemzést a TaqMan™ SNP Genotyping Assay technológiával (Applied Biosystems™) végezzük. Az SNP-ket paraffinba ágyazott betegmintákból izolált DNS-ben értékelik.

Mintanagyság és statisztikai elemzés

A minimális mintaszám kiszámítása a projekt céljainak maradéktalan megvalósítása érdekében történik. Tekintettel arra, hogy a GC esetek körülbelül 90%-a valóban GAC, 5%-os hibaarány és 95%-os konfidencia intervallum mellett a vizsgálók eredetileg 200 betegből álló mintát vetítettek előre. A kutatók azonban a mintaveszteség 15%-os arányát is figyelembe vették (hibás minták vagy betegek lemorzsolódása), ami összesen 230 beteget jelentett.

A minőségi és mennyiségi változók, például a relatív és abszolút gyakoriságok, gyakorisági táblázatok, átlag, medián, szórás, tartomány és kvartilisek elemzésére szabványos leíró statisztikákat kell használni. A 95%-os megbízhatóságot megfelelőnek tekintjük az elemzéshez. Leíró statisztikákat is használnak a mért legrelevánsabb klinikai paraméterek jellemzésére. A kategorizált változók társítását chi-négyzet vagy Fisher-féle egzakt tesztek végzik. Az egyik karú varianciaanalízis összehasonlítja a folytonos változókat a csoportok között. A túlélési eredmények vizsgálata a Kaplan-Meier módszerrel történik. A prognosztikai tényezőket a Cox-féle arányos veszélyek regressziós modellje szerint értékeljük.

Elvégzik a génváltozatok főkomponens-analízisét (PCA), és értékelik az első főkomponensek asszociációját egy kis előre meghatározott genomiális módosítási aláíráskészlettel. A molekuláris alcsoportok meghatározásához a kutatók felügyelet nélküli klaszterezést alkalmaznak. A molekuláris altípusok összefüggése a klinikai adatokkal (pl. életkor, nem, Lauren osztály) és a klinikai eredmények (pl. teljes túlélés, válaszarány) kerül értékelésre. Ezenkívül a klinikai eredmények alapján felügyelt osztályozást végeznek, és mindkét megközelítés eredményül kapott csoportjait összehasonlítják más bejelentett molekuláris altípusokkal.

Betegvédelem/írásos beleegyező nyilatkozatok

Minden fél garantálja a betegek személyes adatainak védelmét. A betegnevek semmilyen formában nem szerepelnek a lap-jelentésekben, kiadványokban vagy a vizsgálatból származó publikálható dokumentumokban, kivéve a törvény által előírt dokumentumokat. A tájékozott hozzájárulási űrlapokat szigorúan a törvényi és helyi előírások betartásával dolgozzák ki. Az írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezési formanyomtatványokat, beleértve a vizsgálat során végrehajtott összes változtatást, a Belső Ellenőrző Testületnek/független Etikai Bizottságnak és a CEMP-nek jóvá kell hagynia, mielőtt beépítenék a vizsgálatba.

A vizsgálók, képviselők vagy egészségügyi szolgáltatók minden betegtől vagy törvényes képviselőtől írásos beleegyező nyilatkozatot kapnak a vizsgálat bármely konkrét tevékenysége előtt.