糖尿病和脂质蓄积与心脏移植 (DCM-AHEAD)

背景技术心力衰竭(HF)是一种日益严重的疾病，其患病率和发病率分别约为总人口的1%和0.15%，在美国影响至少300,000名患者。 然而，对于晚期心力衰竭、最大药物治疗以及支持心律和心脏循环功能的装置难以治愈的情况，唯一有效的治疗选择仍然是心脏移植。 与非糖尿病患者相比，患有晚期心力衰竭的糖尿病患者似乎从这种疗法中受益。 另一方面，在患有晚期心力衰竭并选择进行心脏移植的患者中，糖尿病可能会导致不同程度的结构和分子病理学，这些病理学不存在，或者至少以不同的方式存在于选择用于相同 HF 病因的非糖尿病患者中、临床特征和 HF 分期。 因此，在这项研究中，作者将研究解剖病理学、细胞和分子特征，作为糖尿病患者与非糖尿病患者的炎症、氧化、凋亡和表观遗传表达的途径。受特发性扩张型心肌病 (IDCM) 影响，因此在没有缺血性心脏病，并转诊至心脏中心进行心脏移植。 作者的研究假设是，糖尿病可以调节 IDCM 患者不同程度的结构、细胞和分子病理学。非糖尿病患者，由于代谢活动过度，炎症、氧化和凋亡分子的合成和释放增加。 这些研究将侧重于从糖尿病患者和非糖尿病 IDCM 患者中提取并在心脏移植过程中移除的心脏组织的细胞代谢的显微、组织学和功能分析。 然而，在随后的离体阶段，作者将评估与从心肌组织样本中获得的不同微观组织模式相关的细胞、分子、炎症和表观遗传效应。 根据作者的调查，这些新确定的糖尿病患者与非糖尿病患者心衰分子和细胞过程的靶点在未来可能被用作特定的治疗靶点，以改善患有晚期心力衰竭的 IDCM 糖尿病患者的临床结果。

材料和方法 研究人群 作者将招募一组选择接受心脏移植的 IDCM 糖尿病患者和非糖尿病患者。 这项研究将在坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”的医学系、心脏外科系和生物化学系进行。 患者的选择、随机分组和入组将在医学科学系进行，然后进行临床随访；心脏移植和心脏组织取样将在心脏外科进行；分子和细胞研究将在生物化学系进行。 随访时间为 12 个月。 糖尿病病理将根据美国心脏协会的国际指南进行诊断。

纳入标准：患者年龄 > 18 岁，

干预 在这项观察性研究中，作者将评估一组受 IDCM 和心力衰竭影响的连续患者（糖尿病与非糖尿病），在 III / IV NYHA 中难以接受最大药物治疗，并在大学心脏外科接受治疗坎帕尼亚“Luigi Vanvitelli”的心脏移植手术。 该研究将分为三个不同的部分进行：人体研究、离体细胞研究、分子研究。

人体研究：在医学科学和心脏外科系进行，入组患者将根据国际心脏移植指南接受心脏移植治疗。 心脏移植后，将对取出的心脏进行心肌组织活检。 干预将在坎帕尼亚大学“Luigi Vanvitelli”的心脏外科进行。

心脏组织分析 从外植心脏中取出一部分肌肉组织（50 克），从中获得 3 部分：一部分将掺入 OCT 化合物并冷冻在液氮中用于免疫组织化学分析，第二部分将立即在氮液中冷冻并保存在-70°C，用于分离RNA，第三部分称重，切成小块（2mm3）并转移到12孔板中。 根据组织的重量，将无血清 DMEM (2 ml/g) 添加到孔中，并在 37°C 的温和波动的 CO2 培养箱中孵育。 在 3 小时时，收集经过调节的土壤并在 4°C 下离心 10 分钟。 来自附感和皮下脂肪组织培养物的上清液将在-70°C下等份储存，用于测量通过ELISA释放的炎症介质。

血液样本

采血将在手术当天早上和后续阶段进行，通过在无热原、有或没有 EDTA 作为抗凝剂的管中采集外周静脉血。 对于血浆，将 EDTA 管置于融化的冰上，然后在 20 分钟内以 1500 g 在 4°C 下离心 10 分钟。血浆将在 80°C 的等分试样中储存，用于所有 ELISA 测试。 坎帕尼亚大学的生物化学实验室将分析血清葡萄糖、脂质组和炎症标志物。

炎症标志物

作者将根据制造商推荐的程序，使用 ELISA（研发系统）分析血浆和心脏炎症的介质。 它们将用于 IL-6 测量的 ELISA 标准试剂盒，以及用于 TNF-α 和 IL-1 测量的高灵敏度 ELISA 试剂盒。 批内变异性将设置为 10%，而批间变异性将设置为 15%。

RNA 分析和实时逆转录

心肌组织样品将在 TriZol 试剂 (Invitrogen) 中切碎并在冰上完全匀化。 将从氯仿中提取总 RNA，并通过 mini RNAasy 柱纯化两次。 在柱上进行 DNase 处理后，RNA 将用无 RNase 的水洗脱。 编码各种炎症介质的转录物将通过 TaqMan 实时反向聚合酶-RT (PCR) 链式反应与 TaqMan Gold RT-PCR 和 PRISM 7700 序列检测系统（Applied Biosystems）进行测量。 PCR 引物和 TaqMan 探针将从 Applied Biosystems 获得并根据制造商的方案进行优化。 PCR反应条件为48℃30分钟，95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟40个循环。 GAPDH 转录物将在单独的试管中扩增，以标准化输入 RNA 中的差异。 各种样品中的 mRNA 将通过相对标准方法使用一系列来自人类血管细胞或白细胞的 RNA 稀释液进行评估。

免疫组化 作者将获得冰冻切片 (10 m)，将其风干 15 分钟，然后在二甲苯中浸泡 10 分钟以去除脂肪。 然后将切片在降低度数的酒精中水合并用苏木精和曙红染色。 根据制造商的协议，选定的连续切片将使用 Universal Elite ABC（Vector Laboratories）试剂盒进行免疫组化。 简而言之，将切片与含 0.3% H2O2 的甲醇一起孵育 30 分钟，然后用马血清或 5% 山羊进行封闭。 在 PBS 中洗涤后，将切片与一抗在湿室中孵育 1 小时。 随后，将载玻片与二抗孵育 30 分钟，然后与抗生物素蛋白-生物素孵育 30 分钟。 然后将切片暴露于 DAB 并用苏木精复染。 将使用以下抗体：CD3（T淋巴细胞，1:50，Novocastra）、CD68（单核细胞/巨噬细胞，1:100，Dako）和三蛋白酶（肥大细胞，1:50，Novocastra）。

随访 出院后，所有患者都需要进行对照访视，正如作者在坎帕尼亚大学心脏外科“Luigi Vanvitelli”心脏移植后患者管理中所指出的那样“和坎帕尼亚大学内科第六师”Luigi Vanvitelli“。 所有患者将在随访后 12 个月内通过临床评估（心电图、压力测试、超声心动图）进行监测，以维持 HbA1c 水平

统计分析 研究人群组（糖尿病患者与非糖尿病患者）将使用分类变量的 Pearson 检验和连续变量的 Kruskal-Wallis 检验进行比较。 将通过关注显着不同的因素（P 值