Diabetes och lipidackumulation och hjärttransplantation (DCM-AHEAD)

BAKGRUND Hjärtsvikt (HF) är en ökande sjukdom, med en prevalens och incidens på cirka 1 % respektive 0,15 % av den allmänna befolkningen, som drabbar minst 300 000 patienter i USA. Men i fall av avancerad hjärtsvikt, motståndskraftig mot maximal medicinsk terapi och apparater som stöder hjärtrytmen och kardiocirkulationsfunktionen, är det enda giltiga terapeutiska alternativet hjärttransplantationen. Diabetespatienter med avancerad hjärtsvikt verkar dra nytta av denna terapi inte annorlunda jämfört med icke-diabetiker. Å andra sidan, hos patienter med avancerad hjärtsvikt och utvalda för hjärttransplantation, kan diabetesen betinga en annan grad av strukturell och molekylär patologi som inte är närvarande, eller närvarande åtminstone på ett annat sätt hos icke-diabetiker som valts ut för samma HF-etiologi , kliniska egenskaper och HF-stadium. Därför kommer författarna i denna studie att studera de anatomiskt-patologiska, cellulära och molekylära egenskaperna, som vägarna för inflammatoriskt, oxidativt, apoptotiskt och epigenetiskt uttryck hos diabetiker kontra icke-diabetiker som påverkas av idiopatisk dilaterad kardiomyopati (IDCM) och därför i frånvaro av ischemisk hjärtsjukdom, och hänvisade till Heart Center för hjärttransplantation. Författarnas studiehypotes är att diabetes kan betinga en annan grad av strukturell, cellulär och molekylär patologi hos patienter med IDCM Vs. icke-diabetespatienter, på grund av överdriven metabolisk aktivitet, med ökad syntes och frisättning av inflammatoriska, oxidativa och apoptotiska molekyler. Dessa undersökningar kommer att fokuseras på mikroskopisk, histologisk och funktionell analys av den cellulära metabolismen av hjärtvävnad extraherad från diabetiker kontra icke-diabetiker IDCM-patienter, och avlägsnas under hjärttransplantation. Men i en efterföljande ex vivo-fas kommer författare att utvärdera cellulära, molekylära, inflammatoriska och epigenetiska effektorer relaterade till de olika mikroskopiska vävnadsmönstren som erhålls från myokardvävnadsprover. Från författarnas undersökningar kan dessa nya identifierade mål för HF-molekylära och cellulära processer hos diabetiker vs icke-diabetiker användas i framtiden som specifika terapeutiska mål för att förbättra kliniska resultat hos IDCM-diabetiker med avancerad hjärtsvikt.

MATERIAL OCH METODER Studiepopulation Författare kommer att registrera en population av IDCM-diabetiker och icke-diabetiker som valts ut för att få en hjärttransplantation. Denna studie kommer att genomföras vid institutionen för medicinska vetenskaper, vid institutionen för hjärtkirurgi och vid institutionen för biokemi vid Campanias universitet "Luigi Vanvitelli". Urval, randomisering och inskrivning av patienter kommer att utföras vid institutionen för medicinska vetenskaper, följt av klinisk uppföljning; Hjärttransplantation och hjärtvävnadsprovtagning kommer att utföras på hjärtkirurgiska avdelningen; Molekylära och cellulära studier kommer att genomföras vid biokemiska institutionen. Uppföljningen kommer att vara 12 månader. Den diabetiska patologin kommer att diagnostiseras enligt de internationella riktlinjerna från American Heart Association.

Inklusionskriterier: patienter > 18 år,

Intervention I denna observationsstudie kommer författarna att utvärdera en kohort av på varandra följande patienter (diabetiker kontra icke-diabetiker) som drabbats av IDCM och hjärtsvikt i klass III/IV NYHA som är refraktär mot maximal medicinsk terapi och behandlas vid avdelningen för hjärtkirurgi vid universitetet av Kampanien "Luigi Vanvitelli" genom hjärttransplantation. Studien kommer att genomföras i tre olika delar: humanstudie, ex vivo cellstudie, molekylär studie.

Mänsklig studie: utförd vid institutionen för medicinska vetenskaper och hjärtkirurgi, den inskrivna patienten kommer att behandlas med hjärttransplantation, enligt de internationella riktlinjerna för hjärttransplantation. Efter hjärttransplantation kommer en biopsi av myokardvävnaden från det avlägsnade hjärtat att utföras. Interventionen kommer att genomföras vid hjärtkirurgiavdelningen vid universitetet "Luigi Vanvitelli" i Kampanien.

Hjärtvävnadsanalys En del av muskelvävnaden (50 gram) kommer att avlägsnas från det explanterade hjärtat, varifrån 3 portioner kommer att erhållas: en del kommer att inkorporeras i OCT-föreningen och frysas i flytande kväve för immunhistokemisk analys, en andra portion kommer att frysas omedelbart i kvävevätska och förvaras vid -70 ° C för isolering av RNA, och en tredje portion kommer att vägas, skäras i små bitar (2 mm3) och överföras till en 12-brunnars platta. Baserat på vävnadens vikt kommer serumfritt DMEM (2 ml / g) att tillsättas till brunnen och inkuberas vid 37 ° C i en mild fluktuerad CO2-inkubator. Efter 3 timmar kommer de konditionerade jordarna att samlas upp och centrifugeras vid 4 ° C i 10 minuter. Supernatanterna från kulturer av epifonisk och subkutan fettvävnad kommer att lagras i alikvoter vid -70 ° C för mätning av inflammationsmediatorer som frisätts med ELISA.

Blodprover

Bloduppsamling kommer att utföras på operationsmorgonen och under uppföljningsfaserna med perifert venöst blod som tas i rör utan pyrogen med eller utan EDTA som antikoagulant. För plasma kommer EDTA-rören att placeras på smält is och sedan centrifugeras inom 20 minuter vid 1500 g i 10 minuter vid 4 ° C. Plasman kommer att lagras i alikvoter vid 80 ° C för alla ELISA-tester. Serumglukos, lipidpaneler och inflammatoriska markörer kommer att analyseras i Campanias universitets biokemilaboratorium.

Inflammatoriska markörer

Författarna kommer att analysera mediatorerna av plasma- och hjärtinflammation med ELISA (Fo-system) enligt den procedur som rekommenderas av tillverkaren. ELISA-standardkit de kommer att användas för IL-6-mätningar och högkänsliga ELISA-kit för TNF-alfa- och IL-1-mätningar. Variabiliteten inom analys kommer att sättas till 10 %, medan variabiliteten mellan analyserna kommer att vara 15 %.

RNA-analys och omvänd transkription i realtid

Prover av myokardvävnad ska malas i ett TriZol-reagens (Invitrogen) och homogeniseras fullständigt på is. Det totala RNA:t kommer att extraheras från kloroformen och renas två gånger genom mini RNAasy-kolonnerna. Efter DNas-behandlingen på en kolonn kommer RNA:t att elueras med RNas-fritt vatten. Transkript som kodar för olika inflammatoriska mediatorer kommer att mätas med TaqMan-kedjereaktionen i realtid omvänd polymeras-RT (PCR) med TaqMan Gold RT-PCR och PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR-primrar och TaqMan-prober kommer att erhållas från Applied Biosystems och optimeras enligt tillverkarens protokoll. PCR-reaktionsbetingelserna kommer att vara vid 48°C under 30 minuter, vid 95°C i 10 minuter, följt av 40 cykler av 95°C i 15 sekunder och 60°C under 1 minut. GAPDH-transkripten kommer att amplifieras i ett separat rör för att normalisera variansen i inmatat RNA. mRNA i olika prover kommer att uppskattas med den relativa standardmetoden med en serie spädningar av RNA från mänskliga kärlceller eller från leukocyter.

Immunhistokemi Författarna kommer att få frysta sektioner (10 m), som kommer att lufttorkas i 15 minuter och nedsänkas i xylen i 10 minuter för att avlägsna fettet. Sektionerna kommer sedan att hydreras i minskande alkoholhalt och färgas med hematoxylin och eosin. De utvalda seriesektionerna kommer att vara immunokemiska med Universal Elite ABC (Vector Laboratories) kit enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat kommer sektionerna att inkuberas med 0,3% H2O2 i metanol i 30 minuter, följt av ett block med hästserum eller 5% get. Efter tvätt i PBS kommer sektionerna att inkuberas med primära antikroppar i 1 timme i en våt kammare. Därefter kommer objektglasen att inkuberas med sekundära antikroppar i 30 minuter följt av avidin-biotin i 30 minuter. Sektionerna kommer sedan att exponeras för DAB och motfärgas med hematoxylin. Följande antikroppar kommer att användas: CD3 (Tlymfocyt, 1:50, Novocastra), CD68 (monocyter/makrofager, 1:100, Dako) och triptaser (mastceller, 1:50, Novocastra).

Uppföljning Efter att ha skrivits ut från sjukhuset kommer alla patienter att behöva genomföra kontrollbesök, som indikeras av författarna om hantering av patienter efter transplantation av hjärta, vid avdelningen för hjärtkirurgi vid Campanias universitet "Luigi Vanvitelli "och den sjätte avdelningen för internmedicin vid University of Campania" Luigi Vanvitelli ". Alla patienter kommer att övervakas i 12 månader efter uppföljning, genom klinisk utvärdering (EKG, stresstest, ekokardiogram) för att bibehålla HbA1c-nivåerna

Statistisk analys Studiens befolkningsgrupper (diabetiker vs icke-diabetiker) kommer att jämföras med Pearson-testet för kategoriska variabler och Kruskal-Wallis-testet för kontinuerliga variabler. Kandidater för tillträde till den multivariata modellen kommer att identifieras genom att fokusera på faktorer som kommer att skilja sig väsentligt (P-värde