Diabetes y Acumulación de Lípidos y Trasplante de Corazón (DCM-AHEAD)

ANTECEDENTES La insuficiencia cardíaca (IC) es una enfermedad en aumento, con una prevalencia e incidencia de alrededor del 1 % y el 0,15 % de la población general, respectivamente, que afecta al menos a 300 000 pacientes en los EE. UU. Sin embargo, en casos de insuficiencia cardiaca avanzada, refractaria a la máxima terapia médica, ya dispositivos de soporte del ritmo cardiaco y de la función cardiocirculatoria, la única opción terapéutica válida sigue siendo el trasplante cardiaco. Los pacientes diabéticos con insuficiencia cardíaca avanzada no parecen beneficiarse de esta terapia de manera diferente en comparación con los no diabéticos. Por otra parte, en pacientes con insuficiencia cardiaca avanzada y seleccionados para trasplante cardiaco, la diabetes puede condicionar un grado diferente de patología estructural y molecular que no está presente, o presente al menos de forma diferente en no diabéticos seleccionados por la misma etiología de IC , características clínicas y estadio de IC. Por tanto, en este estudio los autores estudiarán las características anatomopatológicas, celulares y moleculares, así como las vías de expresión inflamatoria, oxidativa, apoptótica y epigenética en diabéticos vs no diabéticos afectados por miocardiopatía dilatada idiopática (MCID) y por tanto en ausencia de cardiopatía isquémica, y derivado al Centro del Corazón para trasplante cardíaco. La hipótesis del estudio de los autores es que la diabetes puede condicionar un grado diferente de patología estructural, celular y molecular en pacientes con IDCM vs. pacientes no diabéticos, por exceso de actividad metabólica, con aumento de la síntesis y liberación de moléculas inflamatorias, oxidativas y apoptóticas. Estas investigaciones se centrarán en el análisis microscópico, histológico y funcional del metabolismo celular del tejido cardíaco extraído de pacientes con IDCM diabéticos frente a no diabéticos, y extraído durante el trasplante cardíaco. Sin embargo, en una fase ex vivo posterior, los autores evaluarán los efectores celulares, moleculares, inflamatorios y epigenéticos relacionados con los diferentes patrones de tejido microscópico obtenidos a partir de muestras de tejido miocárdico. A partir de las investigaciones de los autores, estos nuevos objetivos identificados de los procesos moleculares y celulares de la IC en diabéticos frente a no diabéticos pueden utilizarse en el futuro como objetivos terapéuticos específicos para mejorar los resultados clínicos en diabéticos IDCM con insuficiencia cardíaca avanzada.

MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio Los autores reclutarán una población de diabéticos y no diabéticos de la IDCM seleccionados para recibir un trasplante de corazón. Este estudio se llevará a cabo en el Departamento de Ciencias Médicas, en el Departamento de Cirugía Cardíaca y en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli". La selección, aleatorización y enrolamiento de los pacientes se realizará en el Departamento de Ciencias Médicas, seguido del seguimiento clínico; El trasplante cardíaco y la toma de muestras de tejido cardíaco se realizarán en el Departamento de Cardiocirugía; Los estudios moleculares y celulares se realizarán en el departamento de bioquímica. El seguimiento será de 12 meses. La patología diabética se diagnosticará según las guías internacionales de la American Heart Association.

Criterios de inclusión: pacientes mayores de 18 años,

Intervención En este estudio observacional, los autores evaluarán una cohorte de pacientes consecutivos (diabéticos frente a no diabéticos) afectados por MCID e insuficiencia cardíaca en clase III/IV NYHA refractarios a la terapia médica máxima y tratados en la División de Cirugía Cardiaca de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli "por trasplante cardíaco. El estudio se llevará a cabo en tres partes diferentes: estudio en humanos, estudio celular ex vivo, estudio molecular.

Estudio en humanos: realizado en el Departamento de Ciencias Médicas y Cirugía Cardíaca, el paciente inscrito será tratado mediante trasplante cardíaco, de acuerdo con las directrices internacionales que rigen el trasplante cardíaco. Después del trasplante cardíaco, se realizará una biopsia de tejido miocárdico del corazón extirpado. La intervención se llevará a cabo en la División de Cardiocirugía de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli".

Análisis del tejido cardíaco Se extraerá una porción de tejido muscular (50 gramos) del corazón explantado, del cual se obtendrán 3 porciones: una porción se incorporará al compuesto OCT y se congelará en nitrógeno líquido para análisis inmunohistoquímico, una segunda porción se se congelará inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenará a -70°C para el aislamiento del ARN, y se pesará una tercera porción, se cortará en trozos pequeños (2 mm3) y se transferirá a una placa de 12 pocillos. En función del peso del tejido, se añadirá al pocillo DMEM sin suero (2 ml/g) y se incubará a 37 °C en un incubador de CO2 con fluctuaciones leves. A las 3 horas se recogerán los suelos acondicionados y se centrifugarán a 4°C durante 10 minutos. Los sobrenadantes de cultivos de tejido adiposo epifónico y subcutáneo se almacenarán en alícuotas a -70°C para la medición de mediadores de inflamación liberados por ELISA.

Muestras de sangre

La extracción de sangre se realizará la mañana de la cirugía y durante las fases de seguimiento mediante sangre venosa periférica extraída en tubos sin pirógenos con o sin EDTA como anticoagulante. Para el plasma, los tubos con EDTA se colocarán sobre hielo derretido, luego se centrifugarán en 20 minutos a 1500 g durante 10 minutos a 4 °C. El plasma se almacenará en alícuotas a 80 °C para todas las pruebas ELISA. La glucosa sérica, los paneles de lípidos y los marcadores inflamatorios se analizarán en el Laboratorio de Bioquímica de la Universidad de Campania.

Marcadores inflamatorios

Los autores analizarán los mediadores de la inflamación plasmática y cardiaca con ELISA (sistemas R&D) según el procedimiento recomendado por el fabricante. Se utilizarán kits estándar ELISA para las mediciones de IL-6 y kits ELISA de alta sensibilidad para las mediciones de TNF-alfa e IL-1. La variabilidad intraensayo se establecerá en un 10 %, mientras que la variabilidad interensayo será del 15 %.

Análisis de ARN y transcripción inversa en tiempo real

Las muestras de tejido miocárdico se triturarán en un reactivo TriZol (Invitrogen) y se homogeneizarán completamente en hielo. El ARN total se extraerá del cloroformo y se purificará dos veces a través de las columnas mini RNAasy. Después del tratamiento con ADNasa en una columna, el ARN se eluirá con agua libre de ARNasa. Las transcripciones que codifican varios mediadores inflamatorios se medirán mediante la reacción en cadena de la polimerasa inversa (PCR) TaqMan en tiempo real con TaqMan Gold RT-PCR y el sistema de detección de secuencias PRISM 7700 (Applied Biosystems). Los cebadores de PCR y las sondas TaqMan se obtendrán de Applied Biosystems y se optimizarán de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las condiciones de reacción de la PCR serán a 48°C durante 30 minutos, a 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Las transcripciones de GAPDH se amplificarán en un tubo separado para normalizar la variación en el ARN de entrada. El mRNA en varias muestras será estimado por el método estándar relativo con una serie de diluciones de RNA de células vasculares humanas o de leucocitos.

Inmunohistoquímica Los autores obtendrán secciones congeladas (10 m), que se secarán al aire durante 15 minutos y se sumergirán en xileno durante 10 minutos para eliminar la grasa. Luego, las secciones se hidratarán en grados decrecientes de alcohol y se teñirán con hematoxilina y eosina. Los cortes seriados seleccionados serán inmunosimoquímicos con el kit Universal Elite ABC (Vector Laboratories) según protocolo del fabricante. Brevemente, las secciones se incubarán con H2O2 al 0,3% en metanol durante 30 minutos, seguido de un bloqueo con suero de caballo o cabra al 5%. Después de lavar en PBS, las secciones se incubarán con anticuerpos primarios durante 1 hora en una cámara húmeda. Posteriormente, los portaobjetos se incubarán con anticuerpos secundarios durante 30 minutos seguidos de avidina-biotina durante 30 minutos. Luego, las secciones se expondrán a DAB y se contrastarán con hematoxilina. Se utilizarán los siguientes anticuerpos: CD3 (Tlinfocito, 1:50, Novocastra), CD68 (monocitos/macrófagos, 1:100, Dako) y triptasas (mastocitos, 1:50, Novocastra).

Seguimiento Después de ser dado de alta del hospital, todos los pacientes deberán realizar visitas de control, como lo indican los autores sobre el manejo de pacientes postrasplante cardíaco, en la División de Cirugía Cardíaca de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli "y la sexta división de Medicina Interna de la Universidad de Campania" Luigi Vanvitelli ". Todos los pacientes serán monitoreados durante 12 meses después del seguimiento, mediante evaluación clínica (ECG, prueba de esfuerzo, ecocardiograma) para mantener los niveles de HbA1c

Análisis estadístico Los grupos de población de estudio (diabéticos vs. no diabéticos) se compararán mediante la prueba de Pearson para variables categóricas y la prueba de Kruskal-Wallis para variables continuas. Los candidatos para la admisión al modelo multivariado se identificarán centrándose en factores que diferirán significativamente (valor P