Diabete e accumulo di lipidi e trapianto di cuore (DCM-AHEAD)

BACKGROUND L'insufficienza cardiaca (HF) è una malattia in aumento, con una prevalenza e un'incidenza rispettivamente di circa l'1% e lo 0,15% della popolazione generale, che colpisce almeno 300.000 pazienti negli Stati Uniti. Tuttavia, nei casi di scompenso cardiaco avanzato, refrattario alla terapia medica massimale, e ai dispositivi a supporto del ritmo cardiaco e della funzione cardio-circolatoria, l'unica valida opzione terapeutica rimane il trapianto cardiaco. I pazienti diabetici con scompenso cardiaco avanzato sembrano trarre beneficio da questa terapia in modo non diverso rispetto ai non diabetici. D'altra parte, nei pazienti con insufficienza cardiaca avanzata e selezionati per il trapianto di cuore, il diabete può condizionare un diverso grado di patologia strutturale e molecolare che non è presente, o presente almeno in modo diverso nei non diabetici selezionati per la stessa eziologia dello scompenso cardiaco. , caratteristiche cliniche e stadio HF. Pertanto, in questo studio gli autori studieranno le caratteristiche anatomo-patologiche, cellulari e molecolari, come le vie di espressione infiammatoria, ossidativa, apoptotica ed epigenetica in diabetici vs. non diabetici affetti da cardiomiopatia dilatativa idiopatica (IDCM) e quindi in assenza di cardiopatia ischemica, e riferito al Centro Cuore per il trapianto cardiaco. L'ipotesi di studio degli autori è che il diabete possa condizionare un diverso grado di patologia strutturale, cellulare e molecolare nei pazienti con IDCM vs. pazienti non diabetici, per eccessiva attività metabolica, con aumentata sintesi e rilascio di molecole infiammatorie, ossidative e apoptotiche. Queste indagini saranno focalizzate sull'analisi microscopica, istologica e funzionale del metabolismo cellulare del tessuto cardiaco estratto da pazienti IDCM diabetici vs. non diabetici e rimosso durante il trapianto cardiaco. Tuttavia, in una successiva fase ex vivo gli autori valuteranno effettori cellulari, molecolari, infiammatori ed epigenetici correlati al diverso pattern tissutale microscopico ottenuto da campioni di tessuto miocardico. Dalle indagini degli autori, questi nuovi bersagli identificati dei processi molecolari e cellulari dell'HF nei diabetici rispetto ai non diabetici, potrebbero essere utilizzati in futuro come bersagli terapeutici specifici per migliorare gli esiti clinici nei diabetici IDCM con insufficienza cardiaca avanzata.

MATERIALI E METODI Popolazione studiata Gli autori arruoleranno una popolazione di diabetici e non diabetici IDCM selezionati per ricevere un trapianto di cuore. Questo studio sarà condotto presso il Dipartimento di Scienze Mediche, presso il Dipartimento di Cardiochirurgia, e presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli". La selezione, la randomizzazione e l'arruolamento dei pazienti saranno effettuati presso il Dipartimento di Scienze Mediche, seguiti dal follow up clinico; Il trapianto cardiaco e il prelievo di tessuto cardiaco saranno eseguiti presso il Dipartimento di Cardiochirurgia; Gli studi molecolari e cellulari saranno condotti presso il dipartimento di biochimica. Il follow-up sarà di 12 mesi. La patologia diabetica sarà diagnosticata secondo le linee guida internazionali dell'American Heart Association.

Criteri di inclusione: pazienti di età > 18 anni,

Intervento In questo studio osservazionale, gli autori valuteranno una coorte di pazienti consecutivi (diabetici vs. non diabetici) affetti da IDCM e scompenso cardiaco in classe III/IV NYHA refrattari alla terapia medica massimale e trattati presso la Divisione di Cardiochirurgia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli" per trapianto di cuore. Lo studio sarà condotto in tre diverse parti: studio umano, studio cellulare ex vivo, studio molecolare.

Studio sull'uomo: condotto presso il Dipartimento di Scienze Mediche e Cardiochirurgia, il paziente arruolato sarà trattato con trapianto cardiaco, secondo le linee guida internazionali che disciplinano il trapianto cardiaco. Dopo il trapianto cardiaco, verrà eseguita una biopsia del tessuto miocardico del cuore rimosso. L'intervento sarà condotto presso la Divisione di Cardiochirurgia dell'Università della Campania “Luigi Vanvitelli”.

Analisi del tessuto cardiaco Dal cuore espiantato verrà prelevata una porzione di tessuto muscolare (50 grammi), da cui si otterranno 3 porzioni: una porzione verrà incorporata nel composto OCT e congelata in azoto liquido per l'analisi immunoistochimica, una seconda porzione verrà essere immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a -70°C per l'isolamento dell'RNA, e una terza porzione sarà pesata, tagliata in piccoli pezzi (2 mm3) e trasferita in una piastra da 12 pozzetti. In base al peso del tessuto, al pozzetto verrà aggiunto DMEM privo di siero (2 ml/g) e incubato a 37°C in un incubatore a CO2 a leggera fluttuazione. Dopo 3 ore, i terreni condizionati saranno raccolti e centrifugati a 4°C per 10 minuti. I supernatanti delle colture di tessuto adiposo epifonico e sottocutaneo saranno conservati in aliquote a -70°C per la misura dei mediatori dell'infiammazione rilasciati mediante ELISA.

Campioni di sangue

La raccolta del sangue verrà effettuata la mattina dell'intervento e durante le fasi di follow-up mediante sangue venoso periferico prelevato in provette prive di pirogeno con o senza EDTA come anticoagulante. Per il plasma, le provette EDTA verranno poste su ghiaccio fuso, quindi centrifugate entro 20 minuti a 1500 g per 10 minuti a 4°C. Il plasma verrà conservato in aliquote a 80°C per tutti i test ELISA. Glicemia, pannelli lipidici e marcatori infiammatori saranno analizzati nel Laboratorio di Biochimica dell'Università della Campania.

Marcatori infiammatori

Gli autori analizzeranno i mediatori dell'infiammazione plasmatica e cardiaca con ELISA (sistemi di ricerca e sviluppo) secondo la procedura consigliata dal produttore. Saranno utilizzati kit standard ELISA per le misurazioni di IL-6 e kit ELISA altamente sensibili per le misurazioni di TNF-alfa e IL-1. La variabilità intra-dosaggio sarà fissata al 10%, mentre la variabilità inter-dosaggio sarà del 15%.

Analisi dell'RNA e trascrizione inversa in tempo reale

Campioni di tessuto miocardico saranno tritati in un reagente TriZol (Invitrogen) e omogeneizzati completamente in ghiaccio. L'RNA totale sarà estratto dal cloroformio e purificato due volte attraverso le colonne mini RNAasy. Dopo il trattamento con DNasi su colonna, l'RNA sarà eluito con acqua priva di RNasi. Le trascrizioni che codificano vari mediatori infiammatori saranno misurate mediante la reazione a catena TaqMan real-time reverse-polymerase-RT (PCR) con il TaqMan Gold RT-PCR e il PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). I primer per PCR e le sonde TaqMan saranno ottenuti da Applied Biosystems e ottimizzati secondo il protocollo del produttore. Le condizioni di reazione della PCR saranno a 48°C per 30 minuti, a 95°C per 10 minuti, seguite da 40 cicli di 95°C per 15 secondi e 60°C per 1 minuto. I trascritti GAPDH saranno amplificati in una provetta separata per normalizzare la varianza nell'RNA di input. L'mRNA in vari campioni sarà stimato con il relativo metodo standard con una serie di diluizioni di RNA da cellule vascolari umane o da leucociti.

Immunoistochimica Gli autori otterranno sezioni congelate (10 m), che saranno asciugate all'aria per 15 minuti e immerse in xilene per 10 minuti per rimuovere il grasso. Le sezioni verranno quindi idratate in gradi decrescenti di alcool e colorate con ematossilina ed eosina. Le sezioni seriali selezionate saranno immunosimochimiche con il kit Universal Elite ABC (Vector Laboratories) secondo il protocollo del produttore. In breve, le sezioni saranno incubate con 0.3% H2O2 in metanolo per 30 minuti, seguite da un blocco con siero di cavallo o 5% di capra. Dopo il lavaggio in PBS, le sezioni saranno incubate con anticorpi primari per 1 ora in camera umida. Successivamente, i vetrini saranno incubati con anticorpi secondari per 30 minuti seguiti da avidina-biotina per 30 minuti. Le sezioni saranno quindi esposte a DAB e controcolorate con ematossilina. Verranno utilizzati i seguenti anticorpi: CD3 (Tlymphocyte, 1:50, Novocastra), CD68 (monociti/macrofagi, 1:100, Dako) e triptasi (mastociti, 1:50, Novocastra).

Follow-up Dopo essere stati dimessi dall'ospedale, tutti i pazienti saranno tenuti ad effettuare le visite di controllo, come indicato dagli Autori sulla gestione dei pazienti post-trapianto cardiaco, presso la Divisione di Cardiochirurgia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli "e la sesta divisione di Medicina Interna dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli". Tutti i pazienti saranno monitorati per 12 mesi dopo il follow-up, mediante valutazione clinica (ECG, stress test, ecocardiogramma) per mantenere i livelli di HbA1c

Analisi statistica I gruppi di popolazione in studio (diabetici vs. non diabetici) saranno confrontati utilizzando il test di Pearson per le variabili categoriche e il test di Kruskal-Wallis per le variabili continue. I candidati per l'ammissione al modello multivariato saranno identificati concentrandosi su fattori che differiranno in modo significativo (P value