Diabetes und Lipidakkumulation und Herztransplantation (DCM-AHEAD)

HINTERGRUND Herzinsuffizienz (HF) ist eine zunehmende Krankheit mit einer Prävalenz und Inzidenz von etwa 1 % bzw. 0,15 % der allgemeinen Bevölkerung, von der mindestens 300.000 Patienten in den USA betroffen sind. Bei fortgeschrittener Herzinsuffizienz, die auf eine maximale medikamentöse Therapie und auf Geräte zur Unterstützung des Herzrhythmus und der Herz-Kreislauf-Funktion nicht anspricht, bleibt jedoch die Herztransplantation die einzig gültige therapeutische Option. Diabetiker mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz scheinen von dieser Therapie nicht anders zu profitieren als Nicht-Diabetiker. Andererseits kann der Diabetes bei Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz, die für eine Herztransplantation ausgewählt wurden, einen unterschiedlichen Grad an struktureller und molekularer Pathologie bedingen, der bei Nicht-Diabetikern, die für die gleiche HF-Ätiologie ausgewählt wurden, nicht vorhanden ist oder zumindest auf eine andere Weise vorhanden ist , klinische Merkmale und HF-Stadium. Daher werden die Autoren in dieser Studie die anatomisch-pathologischen, zellulären und molekularen Eigenschaften sowie die Wege der entzündlichen, oxidativen, apoptotischen und epigenetischen Expression bei Diabetikern im Vergleich zu Nicht-Diabetikern untersuchen, die von idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie (IDCM) betroffen sind und daher in Abwesenheit der ischämischen Herzkrankheit, und zur Herztransplantation an das Herzzentrum überwiesen. Die Studienhypothese der Autoren lautet, dass Diabetes bei Patienten mit IDCM vs. Nicht-Diabetiker aufgrund übermäßiger Stoffwechselaktivität mit erhöhter Synthese und Freisetzung von entzündlichen, oxidativen und apoptotischen Molekülen. Diese Untersuchungen werden sich auf die mikroskopische, histologische und funktionelle Analyse des Zellstoffwechsels von Herzgewebe konzentrieren, das von Diabetikern im Vergleich zu Nicht-Diabetikern IDCM-Patienten entnommen und während einer Herztransplantation entfernt wurde. In einer anschließenden Ex-vivo-Phase werden die Autoren jedoch zelluläre, molekulare, entzündliche und epigenetische Effektoren bewerten, die mit den verschiedenen mikroskopischen Gewebemustern zusammenhängen, die aus myokardialen Gewebeproben gewonnen wurden. Diese neu identifizierten Ziele der molekularen und zellulären Prozesse der Herzinsuffizienz bei Diabetikern im Vergleich zu Nichtdiabetikern können in den Untersuchungen der Autoren in Zukunft als spezifische therapeutische Ziele zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse bei IDCM-Diabetikern mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz verwendet werden.

MATERIALIEN UND METHODEN Studienpopulation Die Autoren werden eine Population von IDCM-Diabetikern und Nicht-Diabetikern aufnehmen, die ausgewählt wurden, um eine Herztransplantation zu erhalten. Diese Studie wird an der Abteilung für Medizinische Wissenschaften, an der Abteilung für Herzchirurgie und an der Abteilung für Biochemie der Universität Kampanien „Luigi Vanvitelli“ durchgeführt. Die Auswahl, Randomisierung und Einschreibung der Patienten erfolgt am Department of Medical Sciences, gefolgt von der klinischen Nachsorge; Herztransplantationen und Herzgewebeentnahmen werden in der Abteilung für Herzchirurgie durchgeführt; Molekulare und zelluläre Studien werden in der Abteilung Biochemie durchgeführt. Die Nachbeobachtungszeit beträgt 12 Monate. Die diabetische Pathologie wird gemäß den internationalen Richtlinien der American Heart Association diagnostiziert.

Einschlusskriterien: Patienten > 18 Jahre,

Intervention In dieser Beobachtungsstudie werden die Autoren eine Kohorte konsekutiver Patienten (Diabetiker vs. Nicht-Diabetiker) mit IDCM und Herzinsuffizienz der Klasse III/IV NYHA, refraktär gegenüber maximaler medikamentöser Therapie, bewerten und in der Abteilung für Herzchirurgie der Universität behandelt von Kampanien „Luigi Vanvitelli“ durch Herztransplantation. Die Studie wird in drei verschiedenen Teilen durchgeführt: Studie am Menschen, Ex-vivo-Zellstudie, molekulare Studie.

Studie am Menschen: durchgeführt in der Abteilung für medizinische Wissenschaften und Herzchirurgie, der eingeschriebene Patient wird gemäß den internationalen Richtlinien für Herztransplantationen mit einer Herztransplantation behandelt. Nach der Herztransplantation wird eine Biopsie des Myokardgewebes des entfernten Herzens durchgeführt. Der Eingriff wird in der Abteilung für Kardiochirurgie der Universität "Luigi Vanvitelli" in Kampanien durchgeführt.

Analyse des Herzgewebes Eine Portion Muskelgewebe (50 Gramm) wird aus dem explantierten Herzen entnommen, aus der 3 Portionen gewonnen werden: eine Portion wird in die OCT-Verbindung eingearbeitet und in flüssigem Stickstoff zur immunhistochemischen Analyse eingefroren, eine zweite Portion wird sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C für die Isolierung von RNA gelagert werden, und eine dritte Portion wird gewogen, in kleine Stücke geschnitten (2 mm3) und auf eine Platte mit 12 Vertiefungen übertragen. Basierend auf dem Gewicht des Gewebes wird serumfreies DMEM (2 ml/g) in die Vertiefung gegeben und bei 37 °C in einem mild schwankenden CO2-Inkubator inkubiert. Nach 3 Stunden werden die konditionierten Böden gesammelt und 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände aus Kulturen von epiphonischem und subkutanem Fettgewebe werden in Aliquots bei –70°C für die Messung von freigesetzten Entzündungsmediatoren mittels ELISA gelagert.

Blutproben

Die Blutentnahme erfolgt am OP-Morgen und in den Nachsorgephasen per peripher venösem Blut in pyrogenfreien Röhrchen mit oder ohne EDTA als Gerinnungshemmer. Für Plasma werden die EDTA-Röhrchen auf geschmolzenes Eis gestellt, dann innerhalb von 20 Minuten bei 1500 g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wird für alle ELISA-Tests in Aliquots bei 80 °C gelagert. Serumglukose, Lipidpanels und Entzündungsmarker werden im Labor für Biochemie der Universität Kampanien analysiert.

Entzündungsmarker

Die Autoren werden die Mediatoren von Plasma- und Herzentzündungen mit ELISA (F&E-Systeme) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren analysieren. ELISA-Standardkits werden für IL-6-Messungen und hochempfindliche ELISA-Kits für TNF-alpha- und IL-1-Messungen verwendet. Die Intra-Assay-Variabilität wird auf 10 % festgelegt, während die Inter-Assay-Variabilität 15 % beträgt.

RNA-Analyse und Reverse Transkription in Echtzeit

Proben von Myokardgewebe werden in einem TriZol-Reagenz (Invitrogen) zerkleinert und vollständig auf Eis homogenisiert. Die Gesamt-RNA wird aus dem Chloroform extrahiert und zweimal über die Mini-RNAasy-Säulen gereinigt. Nach der DNase-Behandlung auf einer Säule wird die RNA mit RNase-freiem Wasser eluiert. Transkripte, die verschiedene Entzündungsmediatoren codieren, werden durch die TaqMan Echtzeit-Reverse-Polymerase-RT (PCR)-Kettenreaktion mit der TaqMan Gold RT-PCR und dem PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) gemessen. PCR-Primer und TaqMan-Sonden werden von Applied Biosystems bezogen und gemäß dem Protokoll des Herstellers optimiert. Die PCR-Reaktionsbedingungen sind 30 Minuten bei 48°C, 10 Minuten bei 95°C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C. Die GAPDH-Transkripte werden in einem separaten Röhrchen amplifiziert, um die Varianz in der Input-RNA zu normalisieren. Die mRNA in verschiedenen Proben wird durch das relative Standardverfahren mit einer Reihe von Verdünnungen von RNA aus menschlichen Gefäßzellen oder aus Leukozyten geschätzt.

Immunhistochemie Die Autoren erhalten Gefrierschnitte (10 m), die 15 Minuten lang luftgetrocknet und 10 Minuten lang in Xylol getaucht werden, um das Fett zu entfernen. Die Schnitte werden dann in abnehmendem Alkoholgehalt hydratisiert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die ausgewählten seriellen Schnitte werden mit dem Universal Elite ABC (Vector Laboratories)-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers immunsimochemisch bestimmt. Kurz gesagt werden die Schnitte mit 0,3 % H2O2 in Methanol für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einem Block mit Pferdeserum oder 5 % Ziege. Nach dem Waschen in PBS werden die Schnitte mit primären Antikörpern für 1 Stunde in einer Nasskammer inkubiert. Anschließend werden die Objektträger 30 Minuten lang mit Sekundärantikörpern und anschließend 30 Minuten lang mit Avidin-Biotin inkubiert. Die Schnitte werden dann DAB ausgesetzt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Folgende Antikörper werden verwendet: CD3 (Tlymphozyten, 1:50, Novocastra), CD68 (Monozyten/Makrophagen, 1:100, Dako) und Triptasen (Mastzellen, 1:50, Novocastra).

Nachsorge Nach der Entlassung aus dem Krankenhaus müssen alle Patienten Kontrollbesuche in der Abteilung für Herzchirurgie der Universität Kampanien "Luigi Vanvitelli" durchführen, wie von den Autoren zum Management von Patienten nach Herztransplantation angegeben "und die sechste Abteilung für Innere Medizin der Universität von Kampanien" Luigi Vanvitelli ". Alle Patienten werden nach der Nachsorge 12 Monate lang durch klinische Bewertung (EKG, Belastungstest, Echokardiogramm) überwacht, um den HbA1c-Spiegel aufrechtzuerhalten

Statistische Analyse Die Studienpopulationsgruppen (Diabetiker vs. Nichtdiabetiker) werden unter Verwendung des Pearson-Tests für kategoriale Variablen und des Kruskal-Wallis-Tests für kontinuierliche Variablen verglichen. Kandidaten für die Zulassung zum multivariaten Modell werden identifiziert, indem man sich auf Faktoren konzentriert, die sich signifikant unterscheiden (P-Wert