患者和健康家庭对照的神经退行性疾病诱导干细胞研究。 (NeuronsiPS)

1. 引言 由于许多病例缺乏有效和持久的治疗方法，神经和神经退行性疾病对家庭和国家卫生服务产生重大影响。 缺乏这些治疗策略在很大程度上是由于难以在体外对这些病理进行建模。 事实上，不可能在体外培养人类神经元，这迫使使用不能充分概括这些人类病理复杂性的动物细胞模型。 出于这个原因，有必要继续开发人类起源的体外模型，以再现这些疾病的分子和生化特征。

   细胞重编程的发现允许通过转化取自成人个体的体细胞生成多能干细胞。 该技术基于 4 个基因 OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 的表达，它们协同作用足以将体细胞转化为称为 iPS 的诱导干细胞 (1,2)。 京都大学的 S. Yamanaka 教授因这项技术荣获 2012 年诺贝尔医学奖 (3)。 人类 iPS 诱导的干细胞可以随着时间的推移以稳定的方式在体外维持，然后分化成任何特化细胞，包括神经元和神经胶质细胞。 因此，通过这种方式，可以从患有神经病理学疾病的成年个体中生成人类神经元，从而可以研究受这些疾病影响的细胞的病理生理机制。 近年来的研究已经建立了许多可靠的方案来将人类 iPS 细胞分化为不同的神经元亚型（谷氨酸能、氨基丁酸能、多巴胺能）、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞 (4-6)。 由于这些程序，通过创建非常有用的系统来研究病理过程和确定阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和自闭症的某些遗传形式的新治疗靶标，可以生成许多神经系统疾病的神经元和神经胶质模型 (7-9)。

   提议小组在通过重新编程生成 iPS 细胞以及将它们分化为神经元和神经胶质细胞以用于神经疾病细胞研究方面已经拥有丰富的经验。 例如，Broccoli 博士的小组从患有帕金森病和 OPA1 基因突变的患者中生成了 iPS 细胞 (8)。 对由这些 iPS 细胞分化的神经元的研究允许识别神经元功能障碍基础上的线粒体缺陷，并首次确定多巴胺能神经元的退化如何也依赖于称为坏死性凋亡的细胞死亡移动模式 (8)。

   因此，研究人员建议从具有导致神经和神经退行性疾病的基因突变的患者中建立 iPS 细胞系，以在体外生成神经元和神经胶质细胞模型，用于研究病理机制和验证新的未来实验疗法。

2. 研究的目的和绘图 本研究的目的是从患有神经和神经退行性疾病的患者中生成 iPS 诱导的干细胞系，以分化为神经元和神经胶质细胞，以研究这些疾病的病理细胞和分子过程。 这些体外培养物也将用于验证分子或实验性治疗方法。 IPS 细胞将通过对分离的 10 mL 外周静脉血细胞进行重新编程而产生。

因此，该研究涉及从

1. 携带基因突变的受试者会导致神经系统疾病和/或神经退行性疾病的发展。
2. 亲属或家庭控制非基因突变携带者调节代谢和/或神经退行性疾病的发展（健康供体）。

3. 实验阶段

1. 神经科就诊后，神经科医生会要求进行神经科会诊。
2. 进行遗传咨询并确定要进行的分子测试。 根据每种病理学的特定国家指南应用经典诊断路径（SIGU：http://www.sigu.net/show/attivita/5/1/LINEE%20GUIDA%20SIGU） 这表明最适合分析的分析，最重要的是更频繁地涉及。
3. 签署知情同意书后采集血样（知情同意书 Neuromed 版本 12.02.2015） 用于诊断研究。 将采集大约 10 毫升血液，随后一部分将被分离成血清和淋巴细胞，这些血液将储存在 -80°C 下。
4. 分子分析在 IRCCS INM 神经医学研究所的分子遗传学中心通过 NGS 或 Sanger 测序、多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 和微卫星进行。
5. 如果分子诊断已经确定了与临床表型相容的基因和/或感兴趣的变异，或者已经确定了具有不确定临床意义的变异（VoUS），则在对象中评估生成患者的iPS干细胞的真正科学重要性
6. 如果产生此类细胞的可能性得到积极评估，在咨询期间，在撤回报告的同时，将征求患者的同意（知情同意书 Neuromed 版本 12.02.2015）参与该研究方案。 采集 10 毫升外周血样本。
7. 装有 EDTA 作为抗凝剂的试管中的血液样本通过快递送到圣拉斐尔医院 (OSR) 的 Vania Broccoli 博士的实验室，在那里血液中的单核细胞将被重新编程为 iPS 干细胞。
8. OSR产生的部分iPS干细胞将被送往NEUROMED，以确认病理突变和正确的细胞遗传学
9. iPS 干细胞将分化为神经元和胶质细胞，用于研究神经病理学的病理机制。
10. iPS 干细胞等分试样将在 OSR 和 NEUROMED 中冷冻保存在液氮中，以确保维持细胞系直至研究结束。

4. 材料和方法 外周血单核细胞的重编程 一旦获得 10 毫升外周静脉血，将分离单核细胞 (PBMC) 并使用仙台 RNA 病毒进行重编程，该病毒表达 4 个基因 SOX2、OCT4、KLF4 和 c -MYC 没有整合到细胞基因组中。 该手术将在米兰圣拉斐尔医院神经科学部 Vania Broccoli 博士实验室的无菌 BL2 房间内进行。

然后将 PBMC 接种在无菌 10 mm 培养皿中的成纤维细胞垫上，培养基中富含细胞因子 bFGF (4ng / ml) (8)。 在这些培养条件下，第一个 iPS 重编程干细胞克隆将在大约 30 天后可见。 此时，单个克隆将被分离和生长以扩大细胞数量并建立增殖系。 将研究单克隆的后代，以通过以下方式验证多能干细胞中的正确重编程：1) 激活多能干细胞状态的标记基因（Nanog、Sox2、Oct4、SEEA4）、体细胞体外分化能力胚胎内胚层、中胚层和外胚层三层的细胞，培养中分化细胞的污染最小。 一旦诱导多能干细胞生成 (iPS) 得到验证，这些细胞将被用于分化成不同的神经元和神经胶质类型，用于旨在理解和描述受试者所研究疾病的发病机制的实验。 对于神经元的生成，将遵循 Shi 及其同事 (5) 开发的方案，该方案使用视黄酸和 TGFbeta / BMP 蛋白抑制剂来指导神经外胚层分化。 此程序已在我们的实验室中得到验证和使用，展示了 iPS 干细胞分化为成熟且功能正常的神经元 (10)（图 1）。

一旦确定了 iPS 干细胞的分化过程，研究人员将着手分析患者细胞的表型，以及来自健康对照的对照。 特别是，关于神经元的分析，将研究存活参数、通过电生理记录的神经元活动、线粒体形态和代谢、内质网应激以及突触形成和功能。 对于胶质细胞，将分析炎症水平，包括 TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6 和 NOS 蛋白的活性。 除了这些研究，还将通过比较神经元和神经胶质细胞的基因表达谱来进行基因组分析。 分析将针对 RNA-Seq 进行，这是一种“下一代测序”技术，可以分析基因组中所有基因的表达水平。 如此鉴定的基因将通过实时 PCR 分析进行验证，并将在源自患者细胞的神经元和细胞中研究它们的功能。

5. 统计 对于病理过程的研究，将从每个患者和健康个体中提取 6 个 iPS 细胞系。 研究人员根据我们以前的经验预计，患者和健康供体之间的这些线数之间的比较足以对将要进行的不同体外实验具有统计意义。 以防在极少数情况下有可能从同一患者身上产生新的 iPS 细胞系。

6. 伦理方面 研究中报告的有关执行、执行和记录的程序旨在确保赫尔辛基宣言及其修订版中规定的伦理原则得到维护。 该研究将在考虑监管要求和法律义务的情况下进行。 特别是，规范参考由关于非营利研究的 DL n.211、24/06/2003 和 DM 17/12/2004 代表。 此外，在入组前，所有可能符合条件的患者都将收到有关该研究的完整而全面的信息。 根据关于个人保护和个人数据处理的第 196/03 号法律，患者必须同意参与研究和个人数据处理才能被纳入。 将使用伦理委员会事先批准的知情同意书。

7. 最终目标 该计划旨在确定受所讨论的神经病理学影响的人类细胞（神经元和 i）中完全改变的亚细胞过程。 此外，这项研究还将使我们能够整合分子数据，以识别其特定改变可能导致这些细胞功能障碍的基因。 该实验计划的最终目的是确定这些疾病背后特定分子机制的改变。 这些新知识对于思考基于药理学方法或基因疗法的新转化策略的发展至关重要。 这是非常重要的，因为所讨论的疾病是有效治疗的孤儿并且仅限于完全对症治疗。

8. 项目成本 分子诊断是在 IRCCS Neuromed 的分子遗传学中心常规进行的。 没有额外费用，因为分析是根据 NHS 协议执行的诊断程序的一部分。

IPS 生成由 IRCCS San Raffaele 执行。 因此，开发这些生产线的成本完全取决于它们。