Estudo de células-tronco induzidas por doenças neurodegenerativas em pacientes e controles familiares saudáveis. (NeuronsiPS)

1. INTRODUÇÃO As doenças neurológicas e neurodegenerativas têm um grande impacto nas famílias e no serviço nacional de saúde devido à falta, em muitos casos, de terapêuticas eficazes e duradouras. A falta dessas estratégias terapêuticas se deve em grande parte à dificuldade de modelar essas patologias in vitro. De fato, a impossibilidade de cultivar neurônios humanos in vitro obrigou ao uso de modelos de células animais que não recapitulam adequadamente a complexidade dessas patologias humanas. Por isso é necessário prosseguir com o desenvolvimento de modelos in vitro de origem humana que reproduzam as características moleculares e bioquímicas dessas doenças.

   A descoberta da reprogramação celular permitiu a geração de células-tronco pluripotentes a partir da conversão de células somáticas retiradas de indivíduos adultos. Esta tecnologia é baseada na expressão dos 4 genes OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC que sinergicamente são suficientes para converter células somáticas em células-tronco induzidas chamadas iPS (1,2). Por esta tecnologia, o Prof. S. Yamanaka, da Universidade de Kyoto, recebeu o Prêmio Nobel de Medicina em 2012 (3). As células-tronco humanas induzidas por iPS podem ser mantidas in vitro de maneira estável ao longo do tempo e, em seguida, diferenciadas em qualquer célula especializada, incluindo neurônios e células gliais. Dessa forma, portanto, é possível gerar neurônios humanos a partir de indivíduos adultos portadores de patologias neurológicas, permitindo o estudo de mecanismos fisiopatológicos em células acometidas por essas doenças. A pesquisa nos últimos anos estabeleceu muitos protocolos confiáveis ​​para diferenciar as células iPS humanas em diferentes subtipos de neurônios (glutamatérgicos, GABAérgicos, dopaminérgicos), astrócitos, oligodendrócitos e microglia (4-6). Graças a estes procedimentos foi possível gerar modelos neuronais e gliais de muitas doenças neurológicas criando sistemas muito úteis para estudar processos patológicos e identificar novos alvos terapêuticos para algumas formas genéticas de Alzheimer, Parkinson e autismo (7-9).

   O grupo proponente já tem grande experiência em gerar células iPS por reprogramação e em diferenciá-las em neurônios e glia úteis para estudos celulares de doenças neurológicas. Como exemplo, o grupo do Dr. Broccoli gerou células iPS de pacientes com doença de Parkinson e mutações no gene OPA1 (8). O estudo de neurônios diferenciados por essas células iPS permitiu identificar defeitos mitocondriais na base de disfunções neuronais e identificar pela primeira vez como a degeneração de neurônios dopaminérgicos também depende de um modo móvel de morte celular chamado necroptose (8).

   Os investigadores propõem-se assim estabelecer linhagens de células iPS de doentes com mutações genéticas responsáveis ​​por doenças neurológicas e neurodegenerativas para gerar modelos neuronais e gliais in vitro para o estudo de mecanismos patológicos e validação de novas terapias experimentais futuras.

2. OBJETIVO E DESENHO DO ESTUDO O objetivo deste estudo é gerar linhagens de células-tronco induzidas por iPS de pacientes com doenças neurológicas e neurodegenerativas para diferenciar em neurônios e células gliais para estudar os processos patológicos celulares e moleculares dessas doenças. Estas culturas in vitro também serão usadas para validar moléculas ou abordagens terapêuticas experimentais. As células IPS serão geradas pela reprogramação de células isoladas de 10 mL de sangue venoso periférico.

O estudo, portanto, envolve a coleta de 10 ml de sangue periférico de

1. Sujeitos portadores de mutações genéticas que condicionam o desenvolvimento de doenças neurológicas e/ou neurodegenerativas.
2. Parentes ou familiares de controle não portadores de mutações genéticas que condicionam o desenvolvimento de doenças metabólicas e/ou neurodegenerativas (doadores saudáveis).

3. FASE EXPERIMENTAL

1. Na sequência de uma Visita Neurológica, é solicitada uma Consulta Neurológica pelo Neurologista.
2. É realizado o Aconselhamento Genético e identificado o teste molecular a ser realizado. Os caminhos diagnósticos clássicos são aplicados de acordo com as diretrizes nacionais específicas para cada patologia (SIGU: http://www.sigu.net/show/attivita/5/1/LINEE%20GUIDA%20SIGU) que indicam a análise dos mais aptos a analisar e sobretudo os mais frequentemente envolvidos.
3. Uma amostra de sangue é coletada após a assinatura de um formulário de consentimento informado (consentimento informado Neuromed versão 12.02.2015) para o estudo diagnóstico. Serão colhidos aproximadamente 10 mililitros de sangue e posteriormente uma parte será fracionada em soro e linfócitos que serão armazenados a -80°C.
4. As análises moleculares são realizadas no Centro de Genética Molecular do IRCCS INM Neuromed Institute através de NGS ou Sanger Sequencing, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) e Microssatélites.
5. Se o diagnóstico molecular identificou um gene e/ou uma variante de interesse compatível com o fenótipo clínico, ou identificou uma variante com significado clínico incerto (VoUS), a real importância científica da geração das células-tronco iPS do paciente é avaliada em objetos
6. Se a possibilidade de gerar tais células for avaliada positivamente, durante a consulta, concomitantemente à retirada do laudo, é solicitado ao paciente o seu consentimento (consentimento informado Neuromed versão 12.02.2015) para participar deste protocolo de pesquisa. Uma amostra de sangue periférico de 10 ml é realizada.
7. Amostras de sangue em tubos com EDTA como anticoagulante são enviadas por correio expresso ao laboratório da Dra. Vania Broccoli no Hospital San Raffaele (OSR), onde as células mononucleares do sangue serão reprogramadas em células-tronco iPS.
8. Parte das células-tronco iPS geradas na OSR serão enviadas ao NEUROMED para confirmação da mutação patológica e o correto genético celular
9. Células-tronco iPS serão diferenciadas em neurônios e glia para o estudo dos mecanismos patológicos subjacentes à neuropatologia.
10. Alíquotas de células-tronco iPS serão criopreservadas em nitrogênio líquido tanto no OSR quanto no NEUROMED para garantir a manutenção das linhagens que serão mantidas até o final do estudo.

4. MATERIAIS E MÉTODOS Reprogramação de células mononucleares do sangue periférico Obtidos os 10 ml de sangue venoso periférico, células mononucleares (PBMCs) serão isoladas e reprogramadas utilizando o RNA vírus Sendai, que expressa os 4 genes SOX2, OCT4, KLF4 ec -MYC sem se integrar no genoma celular. Esta operação será realizada em salas estéreis BL2 disponíveis no laboratório da Dra. Vania Broccoli na Divisão de Neurociências do Hospital San Raffaele em Milão.

Em seguida, as PBMCs serão semeadas sobre tapete de fibroblastos em placas de Petri estéreis de 10 mm com meio de cultura enriquecido com a citocina bFGF (4ng/ml) (8). Nessas condições de cultivo, os primeiros clones de células-tronco reprogramadas com iPS serão visíveis após aproximadamente 30 dias. Neste ponto, os clones individuais serão isolados e cultivados para amplificar o número de células e estabelecer linhas proliferativas. A progênie dos clones individuais será estudada para verificar a correta reprogramação em células-tronco pluripotentes através de: 1) ativação de genes marcadores do estado de estaminalidade pluripotente (Nanog, Sox2, Oct4, SEEA4), capacidade de diferenciação in vitro no células do endoderma embrionário de três folhas, mesoderma e ectoderma, contaminação mínima de células diferenciadas na cultura. Uma vez validada a geração induzida de células-tronco pluripotentes (iPS), as células serão utilizadas para serem diferenciadas em diferentes tipos neuronais e gliais para experimentos que visam entender e descrever os mecanismos patogenéticos das doenças dos sujeitos do estudo. Para a geração dos neurônios será seguido o protocolo desenvolvido por Shi e colaboradores (5) que utiliza ácido retinóico e inibidores das proteínas TGFbeta/BMP para direcionar a diferenciação neuroectodérmica. Este procedimento já foi validado e utilizado em nossos laboratórios demonstrando a diferenciação de células-tronco iPS em neurônios maduros e funcionais (10) (Figura 1).

Uma vez estabelecidos os processos de diferenciação com as células-tronco iPS, os pesquisadores procederão à análise do fenótipo nas células dos pacientes em relação aos controles derivados de controles saudáveis. Em particular, no que diz respeito às análises em neurônios, serão investigados parâmetros de sobrevivência, atividade neuronal através de registros eletrofisiológicos, morfologia e metabolismo mitocondrial, estresse do retículo endoplasmático e formação e funcionamento de sinapses. Para as células gliais serão analisados ​​os níveis de inflamação incluindo a atividade das proteínas TNF-alfa, IL-1beta, IL-4, IL-6 e NOS. Juntamente com esses estudos, uma análise genômica será realizada comparando os perfis de expressão gênica de neurônios e células gliais. A análise será feita para o RNA-Seq, uma técnica de "sequenciamento de próxima geração" que permite analisar os níveis de expressão de todos os genes do genoma. Os genes assim identificados serão validados com análise de PCR em tempo real e seu funcionamento será investigado em neurônios e células derivadas de células do paciente.

5. ESTATÍSTICAS Para o estudo dos processos patológicos serão derivadas 6 linhagens de células iPS de cada paciente e indivíduo saudável. Os pesquisadores antecipam de nossa experiência anterior que a comparação entre este número de linhas entre paciente e doador saudável é mais do que suficiente para ter significância estatística para os diferentes experimentos in vitro que serão realizados. Caso seja possível gerar novas linhas de células iPS do mesmo paciente no caso improvável de ser necessário.

6. ASPECTOS ÉTICOS Os procedimentos relatados no estudo relativos à realização, realização e documentação são elaborados para garantir que os princípios éticos estabelecidos na Declaração de Helsinki e suas revisões sejam respeitados. O estudo será realizado tendo em conta os requisitos regulamentares e as obrigações legais. Em particular, a referência normativa é representada pelo DL n.211, de 24/06/2003 e DM 17/12/2004 sobre estudos sem fins lucrativos. Além disso, antes da inscrição, todos os pacientes potencialmente elegíveis receberão informações completas e abrangentes sobre o estudo. Para a inscrição será necessário que os doentes consintam na participação no estudo e tratamento de dados pessoais, de acordo com a lei 196/03 sobre a proteção de pessoas e tratamento de dados pessoais. Será utilizado o consentimento informado previamente aprovado pelo comitê de ética.

7. OBJETIVOS FINAIS Este programa visa identificar os processos sub-celulares alterados exatamente nas células humanas (neurônios e i) afetadas pelas neuropatologias em questão. Além disso, este estudo também nos permitirá integrar dados moleculares com o objetivo de identificar genes cujas alterações específicas possam estar na base dessas disfunções celulares. O objetivo final deste programa experimental é identificar a alteração de mecanismos moleculares específicos subjacentes a estas doenças. Esses novos conhecimentos serão essenciais para pensar no desenvolvimento de novas estratégias translacionais baseadas em abordagens farmacológicas ou terapia gênica. Isso é de grande importância uma vez que as doenças em questão são órfãs de tratamento eficaz e limitadas a tratamentos exclusivamente sintomáticos.

8. CUSTOS DO PROJETO O diagnóstico molecular é realizado rotineiramente no Centro de Genética Molecular do IRCCS Neuromed. Não há custos adicionais, pois as análises fazem parte de procedimentos diagnósticos realizados em convênio com o NHS.

A geração de IPS é realizada pelo IRCCS San Raffaele. Os custos para o desenvolvimento dessas linhas são, portanto, completamente dependentes deles.