Badanie komórek macierzystych indukowanych chorobami neurodegeneracyjnymi u pacjentów i zdrowych rodzin kontrolnych. (NeuronsiPS)

1. WPROWADZENIE Choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne mają duży wpływ na rodziny i państwową służbę zdrowia ze względu na brak w wielu przypadkach skutecznych i długotrwałych terapii. Brak tych strategii terapeutycznych wynika w dużej mierze z trudności w modelowaniu tych patologii in vitro. W rzeczywistości niemożność hodowli ludzkich neuronów in vitro wymusiła użycie modeli komórek zwierzęcych, które nie odzwierciedlają odpowiednio złożoności tych ludzkich patologii. Z tego powodu konieczne jest kontynuowanie rozwoju modeli in vitro pochodzenia ludzkiego, które odtwarzają molekularną i biochemiczną charakterystykę tych chorób.

   Odkrycie przeprogramowania komórkowego umożliwiło generowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych z konwersji komórek somatycznych pobranych od dorosłych osobników. Technologia ta opiera się na ekspresji 4 genów OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC, które synergistycznie są wystarczające do przekształcenia komórek somatycznych w indukowane komórki macierzyste zwane iPS (1,2). Za tę technologię prof. S. Yamanaka z Uniwersytetu w Kyoto otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny w 2012 roku (3). Ludzkie komórki macierzyste indukowane iPS mogą być utrzymywane in vitro w sposób stabilny w czasie, a następnie różnicowane w dowolne wyspecjalizowane komórki, w tym neurony i komórki glejowe. W ten sposób możliwe jest zatem generowanie ludzkich neuronów z dorosłych osobników cierpiących na patologie neurologiczne, co pozwala na badanie mechanizmów patofizjologicznych w komórkach dotkniętych tymi chorobami. Badania przeprowadzone w ostatnich latach ustaliły wiele niezawodnych protokołów różnicowania ludzkich komórek iPS na różne podtypy neuronów (glutaminergiczne, GABAergiczne, dopaminergiczne), astrocyty, oligodendrocyty i mikroglej (4-6). Dzięki tym zabiegom możliwe było wygenerowanie neuronowych i glejowych modeli wielu chorób neurologicznych poprzez stworzenie bardzo użytecznych systemów do badania procesów patologicznych i identyfikacji nowych celów terapeutycznych dla niektórych genetycznych form choroby Alzheimera, Parkinsona i autyzmu (7-9).

   Grupa proponująca ma już duże doświadczenie w generowaniu komórek iPS poprzez przeprogramowywanie i różnicowanie ich w neurony i glej przydatne w badaniach komórkowych chorób neurologicznych. Na przykład grupa dr Broccoli wygenerowała komórki iPS od pacjentów z chorobą Parkinsona i mutacjami w genie OPA1 (8). Badanie neuronów różnicowanych przez te komórki iPS pozwoliło zidentyfikować defekty mitochondrialne u podstaw dysfunkcji neuronalnych i po raz pierwszy zidentyfikować, w jaki sposób degeneracja neuronów dopaminergicznych zależy również od ruchomego trybu śmierci komórki zwanego nekroptozą (8).

   Badacze proponują zatem ustanowienie linii komórek iPS od pacjentów z mutacjami genetycznymi odpowiedzialnymi za choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne w celu wygenerowania modeli neuronalnych i glejowych in vitro do badania mechanizmów patologicznych i walidacji nowych przyszłych terapii eksperymentalnych.

2. CEL I RYSUNEK BADANIA Celem tego badania jest wygenerowanie indukowanych iPS linii komórek macierzystych od pacjentów z chorobami neurologicznymi i neurodegeneracyjnymi w celu różnicowania się w neurony i komórki glejowe w celu zbadania patologicznych procesów komórkowych i molekularnych tych chorób. Te kultury in vitro zostaną również wykorzystane do walidacji cząsteczek lub eksperymentalnych podejść terapeutycznych. Komórki IPS będą generowane przez przeprogramowanie izolowanych 10-ml komórek obwodowej krwi żylnej.

Badanie obejmuje zatem pobranie 10 ml krwi obwodowej

1. Osoby będące nosicielami mutacji genetycznych warunkujących rozwój chorób neurologicznych i/lub neurodegeneracyjnych.
2. Krewni lub rodzina kontrolują osoby niebędące nosicielami mutacji genetycznych warunkujących rozwój chorób metabolicznych i/lub neurodegeneracyjnych (zdrowi dawcy).

3. FAZA EKSPERYMENTALNA

1. Po wizycie neurologicznej, Neurolog zleca konsultację neurologiczną.
2. Przeprowadzane jest poradnictwo genetyczne i identyfikowany jest test molekularny, który należy wykonać. Klasyczne ścieżki diagnostyczne są stosowane zgodnie z określonymi krajowymi wytycznymi dla każdej patologii (SIGU: http://www.sigu.net/show/attivita/5/1/LINEE%20GUIDA%20SIGU) które wskazują analizy najbardziej odpowiednie do analizy, a przede wszystkim częściej stosowane.
3. Pobranie krwi po podpisaniu formularza świadomej zgody (świadoma zgoda Neuromed wersja 12.02.2015) na badanie diagnostyczne. Zostanie pobrane około 10 mililitrów krwi, a następnie część zostanie frakcjonowana w surowicy i limfocytach, które będą przechowywane w temperaturze -80°C.
4. Analizy molekularne są przeprowadzane w Centrum Genetyki Molekularnej IRCCS INM Neuromed Institute za pomocą sekwencjonowania NGS lub Sangera, multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji (MLPA) i mikrosatelitów.
5. Jeżeli w diagnostyce molekularnej zidentyfikowano gen i/lub wariant będący przedmiotem zainteresowania, zgodny z fenotypem klinicznym, lub wariant o niepewnym znaczeniu klinicznym (VoUS), rzeczywiste znaczenie naukowe wytworzenia komórek macierzystych iPS pacjenta ocenia się na podstawie obiektu
6. W przypadku pozytywnej oceny możliwości wygenerowania takich komórek, podczas konsultacji, jednocześnie z wycofaniem raportu, pacjent proszony jest o wyrażenie zgody (świadoma zgoda Neuromed wersja 12.02.2015) na udział w tym protokole badawczym. Pobiera się 10 ml próbki krwi obwodowej.
7. Próbki krwi w probówkach z EDTA jako antykoagulantem są wysyłane ekspresowym kurierem do laboratorium dr Vania Broccoli w Szpitalu San Raffaele (OSR), gdzie komórki jednojądrzaste krwi zostaną przeprogramowane w komórki macierzyste iPS.
8. Część komórek macierzystych iPS wygenerowanych w OSR zostanie wysłana do NEUROMEDu w celu potwierdzenia patologicznej mutacji i prawidłowej genetyki komórki
9. Komórki macierzyste iPS zostaną zróżnicowane w neurony i glej w celu zbadania patologicznych mechanizmów leżących u podstaw neuropatologii.
10. Porcje komórek macierzystych iPS będą kriokonserwowane w ciekłym azocie zarówno w OSR, jak iw NEUROMED, ​​aby zapewnić utrzymanie linii, które zostaną utrzymane do końca badania.

4. MATERIAŁY I METODY Przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej Po uzyskaniu 10 ml krwi żylnej obwodowej komórki jednojądrzaste (PBMC) zostaną wyizolowane i przeprogramowane przy użyciu wirusa Sendai RNA, który wykazuje ekspresję 4 genów SOX2, OCT4, KLF4 i c -MYC bez integracji z genomem komórki. Operacja ta zostanie przeprowadzona w sterylnych salach BL2 dostępnych w laboratorium dr Vania Broccoli na Oddziale Neurobiologii Szpitala San Raffaele w Mediolanie.

Następnie PBMC zostaną następnie wysiane na macie fibroblastowej na sterylnych szalkach Petriego o średnicy 10 mm z pożywką hodowlaną wzbogaconą cytokiną bFGF (4 ng/ml) (8). W tych warunkach hodowlanych pierwsze przeprogramowane klony komórek macierzystych iPS będą widoczne po około 30 dniach. W tym momencie poszczególne klony będą izolowane i hodowane w celu amplifikacji liczby komórek i ustanowienia linii proliferacyjnych. Potomstwo pojedynczych klonów będzie badane w celu weryfikacji poprawności przeprogramowania pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez: 1) aktywację genów markerowych stanu pluripotencjalnej wytrzymałości (Nanog, Sox2, Oct4, SEEA4), zdolności różnicowania in vitro w komórkach somatycznych komórki trzech arkuszy embrionalnej endodermy, mezodermy i ektodermy, minimalne zanieczyszczenie zróżnicowanych komórek w hodowli. Po zatwierdzeniu indukowanego wytwarzania pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), komórki zostaną wykorzystane do różnicowania na różne typy neuronów i glejów do eksperymentów mających na celu zrozumienie i opisanie mechanizmów patogenetycznych badanych chorób. Do generowania neuronów będzie stosowany protokół opracowany przez Shi i współpracowników (5), który wykorzystuje kwas retinowy i inhibitory białek TGFbeta / BMP do kierowania różnicowaniem neuroektodermalnym. Ta procedura została już zwalidowana i zastosowana w naszych laboratoriach, demonstrując różnicowanie komórek macierzystych iPS w dojrzałe i funkcjonujące neurony (10) (ryc. 1).

Po ustaleniu procesów różnicowania z komórkami macierzystymi iPS badacze przystąpią do analizy fenotypu w komórkach pacjentów w odniesieniu do kontroli pochodzących od osób zdrowych. W szczególności, w odniesieniu do analiz neuronów, zbadane zostaną parametry przeżycia, aktywność neuronów poprzez zapisy elektrofizjologiczne, morfologia i metabolizm mitochondriów, stres retikulum endoplazmatycznego oraz tworzenie i funkcjonowanie synaps. Dla komórek glejowych przeanalizowane zostaną poziomy stanu zapalnego, w tym aktywność białek TNF-alfa, IL-1beta, IL-4, IL-6 i NOS. Wraz z tymi badaniami zostanie przeprowadzona analiza genomiczna poprzez porównanie profili ekspresji genów neuronów i komórek glejowych. Analiza zostanie przeprowadzona dla RNA-Seq, techniki „sekwencjonowania nowej generacji”, która pozwala analizować poziomy ekspresji wszystkich genów w genomie. Zidentyfikowane w ten sposób geny zostaną zweryfikowane za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym, a ich funkcjonowanie zostanie zbadane w neuronach i komórkach pochodzących z komórek pacjenta.

5. STATYSTYKA W celu zbadania procesów patologicznych od każdego pacjenta i osoby zdrowej zostanie uzyskanych 6 linii komórek iPS. Badacze przewidują na podstawie naszych wcześniejszych doświadczeń, że porównanie tej liczby linii między pacjentem a zdrowym dawcą jest więcej niż wystarczające, aby mieć znaczenie statystyczne dla różnych eksperymentów in vitro, które zostaną przeprowadzone. W przypadku, gdy w mało prawdopodobnym przypadku będzie to konieczne, możliwe będzie wygenerowanie nowych linii komórek iPS od tego samego pacjenta.

6. ASPEKTY ETYCZNE Przedstawione w badaniu procedury dotyczące prowadzenia, prowadzenia i dokumentacji mają na celu zapewnienie przestrzegania zasad etycznych określonych w Deklaracji Helsińskiej i jej poprawkach. Badanie zostanie przeprowadzone z uwzględnieniem wymogów regulacyjnych i obowiązków prawnych. W szczególności odniesienie normatywne jest reprezentowane przez DL nr 211 z 24.06.2003 i DM 17.12.2004 w sprawie badań non-profit. Ponadto przed włączeniem do badania wszyscy potencjalnie kwalifikujący się pacjenci otrzymają pełne i wyczerpujące informacje na temat badania. Warunkiem zapisania jest wyrażenie przez pacjentów zgody na udział w badaniu i przetwarzanie danych osobowych, zgodnie z ustawą 196/03 o ochronie osób i przetwarzaniu danych osobowych. Wykorzystana zostanie świadoma zgoda, uprzednio zatwierdzona przez komisję etyczną.

7. CELE KOŃCOWE Celem tego programu jest identyfikacja procesów subkomórkowych zmienionych dokładnie w komórkach ludzkich (neurony i i) dotkniętych omawianymi neuropatologiami. Co więcej, badanie to pozwoli nam również zintegrować dane molekularne w celu identyfikacji genów, których specyficzne zmiany mogą leżeć u podstaw tych dysfunkcji komórkowych. Ostatecznym celem tego programu eksperymentalnego jest identyfikacja zmian specyficznych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych chorób. Ta nowa wiedza będzie niezbędna do myślenia o opracowaniu nowych strategii translacyjnych opartych na podejściach farmakologicznych lub terapii genowej. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ omawiane choroby są sierotami skutecznego leczenia i ograniczają się wyłącznie do leczenia objawowego.

8. KOSZTY PROJEKTU Diagnostyka molekularna wykonywana jest rutynowo w Centrum Genetyki Molekularnej IRCCS Neuromed. Nie wiąże się to z żadnymi dodatkowymi kosztami, ponieważ analizy są częścią procedur diagnostycznych przeprowadzanych w porozumieniu z NFZ.

Generowanie IPS jest wykonywane przez IRCCS San Raffaele. Koszty rozwoju tych linii są zatem całkowicie od nich zależne.