地中海饮食干预对糖尿病心脏病的影响

研究设计：该研究是一项前瞻性、非盲、随机干预临床试验，在 48 名（每组 24 名）II 型糖尿病住院患者中比较 ModMeD 和标准心脏饮食，这些患者计划在 MMC 进行 CABG，并且计划在医院停留手术前四 (4) 天或更长时间。

虽然对受试者或临床医生进行盲法是不可行的，但处理标本和分析对干预的生物反应的实验室研究人员将采用盲法。 具体来说，组织样本在转移到实验室之前将被去识别化和编码。

主要目的：确定地中海饮食是否会导致在 MMC 接受 CABG 手术的 TIIDM 患者的脂质含量（通过质谱测定）和心肌细胞活性（通过 ERBB2 表达水平测定）快速变化。

研究武器：

1. 住院期间的标准心脏糖尿病饮食 (SCaDMD)（CABG 手术前后）
2. 住院期间的地中海饮食 (MedD)（CABG 手术前后）

受试者招募：将在 MMC 招募 48 名住院成人（年龄≥ 18 岁，诊断为 II 型糖尿病，血红蛋白 A1c 水平大于 7.5% 和冠状动脉疾病并计划进行外科血管重建术 (CABG)）。 其他纳入标准包括计划至少 4 天的术前住院时间，以及愿意在住院期间使用地中海饮食限制菜单。

知情同意程序：通过 IRB 批准的部分 HIPAA 豁免，临床团队将筛选符合条件的计划进行 CABG 手术的患者。 他们的临床团队将接触符合条件的受试者，以衡量他们对研究参与的兴趣。 研究团队成员将接触表示有兴趣的患者，以充分解释研究并获得知情同意。 签署本研究知情同意书的患者将同意：1) 进行基线身体测量 2) 在住院期间随机接受地中海饮食或标准心脏 DM 饮食，3) 在当时进行活检他们的 CABG 和捐赠大约一粒米大小的心室心肌组织，4) 捐赠手术中通常丢弃的组织（心脏右心房组织、骨骼肌和脂肪），5) 捐赠总共 30 毫升的血液收集在3 个时间点：CABG 手术之前、期间和 4 天后，6) 填写关于他们食物消费的调查问卷，7) 允许审查他们的医疗记录以了解他们的心血管健康信息。 知情同意书将包括详细的患者责任，例如准确填写饮食问卷，遵守饮食限制，包括要求患者家属不要将外来食品带给患者。 感兴趣的患者及其家属将有充分的机会提问。

学习程序

饮食问卷：在获得知情同意后，所有受试者将完成由在 MMC 的心脏病住院楼层工作的注册营养师提供给他们的饮食问卷 (DHQ II)。 DHQ II 是 NIH 推出的在线食物频率问卷 (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about)。 最初的 DHQI 由风险因素评估处开发，并经过验证表明它提供了合理的营养估计值 26-29。 DHQII 是一个更新版本，增加了 10 种食品（134 种而不是 124 种）和 8 种膳食补充剂。 DHQII 有 4 个版本，在时间范围和部分大小问题上有所不同。 我们将使用包含部分大小的一个月选项（附录 A）。 这是一份由患者自行填写的问卷，大约需要一个小时。 将通过便携式平板电脑或纸质版本向受试者提供在线版本。 DHQII 数据将使用可从 NCI 免费获得的 Diet*Calc 软件程序进行分析 (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/)。 该程序为本研究中使用的 DHQII 标准版本生成营养素和食物组摄入量估计值。 饮食问卷的数据将使我们能够进行许多以前从未尝试过的探索性分析。 例如，我们将寻找某些脂质种类的丰度与患者不饱和脂肪和饱和脂肪摄入量之间的关联。

基线人体测量学：将使用标准临床设备测量身高 (m) 和体重 (kg)，并将由研究团队成员进行验证。 该信息将用于在注册时计算体重指数 (BMI)。 研究小组成员还将测量腰围和臀围。

随机化：在对受试者进行资格筛选并提供知情同意后，他们将以 1:1 的比例随机分配到两种饮食干预措施中的一种。 随机化将由研究统计学家实施，并将涉及在 4 和 6 的交替块中按性别分层。nQuery randomizer 将用于创建随机化方案；随机列表将被转移到密封的、不透明的、按顺序编号的信封中，每个层级一个。 在随机化时，将打开下一个编号的信封以确定研究组分配。 研究营养师将确保传达和遵循饮食分配。

标准心脏 DM 饮食 (SCaDMD)：根据当前的营养指南，所有受试者都将收到来自 MMC 营养师的标准指导和饮食菜单（附录 B）。 根据他们对 DM 和冠心病的诊断。 将为患者开具心脏饮食，这是一种低脂肪饮食，如果从业者需要，可以根据具体情况包括额外的钠或碳水化合物限制。 研究营养师将监督从入组到 CABG 手术后第 4 天每天记录食物消耗的记录，方法是 1) 直接提问，2) 审查患者下的食物订单，以及 3) 用餐完成后检查食物托盘。

地中海饮食 (MedD)：MMC 注册营养师根据 Casas 等人所述的符合地中海饮食的现有 MMC 住院菜单创建了一个子菜单（附录 C）。 (2016)20 并用于 PREDIMED 试验。 本研究中使用的地中海饮食与 PREDIMED 试验中使用的唯一区别是排除了葡萄酒和 sofrito，一种在西班牙、意大利、葡萄牙和拉丁美洲烹饪中用作基础的酱汁。 这是由于 MMC 自助餐厅的限制。 随机化后，研究营养师将与受试者会面以审查 ModMeD 并指导他们的食物选择。 研究营养师还将与楼层护士会面，解释标准饮食和地中海饮食之间的区别，并解释记录食物消耗的研究程序。 研究营养师将监督从登记到 CABG 手术后第 4 天的每日食物消耗记录，方法是 1) 直接提问，2) 审查患者下的食物订单，以及 3) 用餐完成后检查食物托盘。

生物样本采集：心室心肌组织、心房心肌组织和骨骼肋间肌将在研究参与者的 CABG 手术期间采集。 血液样本将在三个时间点采集：1) 入组时（问卷调查和拟人化测量当天），2) 手术当天，以及 3) 出院前。 所有样品都将根据 B 类法规进行去识别化、编码和包装，并通过快递运送到 MMCRI。 样品将由经过培训的实验室人员接收、记录和处理。 如果为此目的获得患者同意，任何未用于本研究的多余组织将由 BioBank 储存和分发用于非特定研究。

样本处理：血液样本将在室温下放置 15-20 分钟，然后离心 30 分钟。 上清液（血清）将被收集并储存在冰上以运输至 MMCRI。 我们进行了评估血清中脂质稳定性的测试，发现脂质在室温下最多可稳定 3 小时。 所有组织将尽快冷冻并在干冰上冷冻运输至 MMCRI。 所有血清和组织样本将储存在-80ºC。 经验表明，样品在这些条件下可保持 1 年以上不变。 当收集完所有样本后，将进行样本分析。

心室组织：前左心室 (LV)、游离壁心外膜活检（1.5 毫米 x 1.5-7 毫米深/长度）将从心脏外科医生在手术时进行搭桥手术的患者身上获得 25、30。 具体而言，活检将在心肺旁路灌注开始后进行，一旦主动脉被夹住并实施心脏停搏液。 在没有心外膜脂肪的左心室前壁表面上选择一个大约米粒大小的区域进行活检。 活检将与其他程序同时进行，以使患者为移植做好准备，并且不会增加整个手术时间。 将组织置于生理缓冲液中进行细胞分离或脂质提取以进行脂质组学分析。 MMCRI 收到组织后将尽快进行细胞分离。 将用于脂质提取的组织可以在 -80ºC 下冷冻。

心房组织：心房组织将来自手术过程中丢弃的右心耳 (RAA)。 心房组织比心室活检大得多，使我们能够细分每个样本。 一件将放入生理缓冲液中进行细胞分离。 第二块将被放置在福尔马林中并用于免疫荧光。 第三个将储存在 RNAlater® 溶液中以在提取前稳定 RNA。 最后一块将被冷冻，用于分离小窝组分、脂质组学和蛋白质分析以及蛋白质印迹。

骨骼肋间肌组织：肋间肌在手术过程中被切除，以进入左乳内动脉，用于提供旁路移植物。 丢弃的肋间骨骼肌将分成两块，一块冷冻用于分离小窝组分、脂质组学和蛋白质分析以及蛋白质印迹，第二块置于福尔马林中用于免疫荧光，置于生理缓冲液中用于细胞分离，或置于 RNAlater® 溶液中以稳定 RNA 直至提取。

血液：手术前将通过静脉穿刺抽取一次基线血样（当患者每天进行临床指示的抽血时，在饮食问卷给药当天），以评估 CAV 的单核细胞表达以及血浆脂质组学概况。 将在另外两个时间点采集后续血样：手术当天通过中心线以及手术后 4 天和出院前通过静脉穿刺。 血液样本将被收集到 2 个 5 毫升试管、一个 ACD（柠檬酸葡萄糖）抗凝剂试管和一个红盖 SST 试管中，并在 3 小时内冷藏或处理。

数据收集：将审查参与者的医疗记录，以提取以下指定的人口统计和临床数据。 患者数据收集将在入组时和手术后大约 1 个月（最多三六个月）进行。 数据将与特定干预数据（问卷数据、拟人化测量和饮食信息）一起输入到研究特定的、符合 HIPAA 的 REDCap 数据库中。 这些数据，包括患者姓名和其他标识符，将仅供临床研究人员访问。 实验室数据将单独保存。 临床数据将被编码并导出，以便在没有其他个人标识符的情况下与实验室数据和分析进行核对。 该代码的链接将仅供临床研究人员访问。

个人身份信息

1. 姓名
2. 出生日期
3. 病历号
4. 入院日
5. 手术日期
6. 出院日期 7.7.2 人口统计

1. 年龄（岁） 2. 性别 (F/M) 3. 种族/民族（OMB 类别） 4. 吸烟史（从不/以前/现在；如果以前/现在，包年） 7.7.2 病史

1. 诊断日期
2. HbA1c 水平
3. 标准脂质谱数据 7.7.2 注册时的用药信息

1. 降糖药（药物、剂量、频率） 2. 降脂药（药物、剂量、频率） 3. 降压药（药物、剂量、频率） 7.7.3 试验特定数据

1. 营养素和食物组摄入量的膳食问卷得分
2. 拟人测量（身高、体重、BMI、臀围和腰围）
3. 每日饮食依从性（是或否；如果否，不遵守什么食物）
4. 每日热量摄入
5. 干预期间体重
6. 采血时间
7. 研究实验室数据（ERBB2 表达数据、脂质组学数据） 7.7.4 临床结果

1. 出院时用药 2. 术后发病率和术后 30 天的存活率

8.0 实验室程序

8.1 ERBB 和其他蛋白质的表达水平： 将通过流式细胞术评估心房内皮细胞中的细胞表面 ERBB2 表达。 此外，ERBB2、CAV1/3 和 IRS-1 的水平将使用特定抗体（CAV1：BD#610058，小鼠或 Cell Signaling；CAV3：BD#610420，小鼠 IRS-1：BD#611395）通过蛋白质印迹法测定， 老鼠。 pY989-IRS-1：Santa Cruz，SC-17200-R，兔，总 ERBB2：Life Technologies。 pERBB2/Tyr1248：Millipore，06-229，结合山羊抗兔 IgG 偶联的 FITC，Abcam，ab6717）。 将在从全血以及分离的心房和心室内皮细胞中收集的循环单核细胞中评估 pAkt 水平。

额外的脂质和蛋白质分析：将基线血浆样本的脂质成分与从相应的心房和心室组织样本中获得的脂质成分进行比较，以评估空腹循环脂质代表组织含量的程度。

非肌细胞单细胞悬液将使用胶原酶 II/分散酶 II 消化从心房组织中制备，如所述36。 ERBB 受体和 CAV1 和 2 水平连同细胞特异性标记物将通过流式细胞术测量。

统计考虑

样本量/功效：先导数据用于确定我们研究人群中几种测量的可能水平，并选择一种用于功效分析，心房内皮细胞中的细胞表面 ERBB2 表达。 使用基于荧光的流式细胞术的试验数据显示，糖尿病患者的该测量值的平均值为 9.56，SD 为 3.14（图 3）。 因此，每个研究组中 24 名患者的目标样本量将允许在该测量中检测到 2.64 的差异（假设在对照组中与我们的初步数据相似，在干预组中更高）具有 80% 的功效和显着性水平为 0.05。 血浆脂质含量和单核细胞信号的二次分析将重复测量分析，这将增加额外的力量，因为我们将对每个人进行多次观察，并且考虑到需要调整 p 值以按时间点进行多重比较，这将减少一些力量。

分析：这将是一项意向性治疗分析。 随机化的成功将通过使用比例或均值和 SDs 使用卡方检验或学生 t 检验（视情况而定）比较基线时的患者特征来评估。 在组内更改（即 delta 分数）和在连续时间点（血清）采取的措施的组间差异将通过混合模型重复测量方差分析进行分析；将需要混合模型，因为患者可能有不同的饮食暴露时间，因此重复测量的次数也不同。 感兴趣的变量是时间、治疗组和治疗相互作用的时间。 模型结果将用于估计组内和组间比较的平均值和随时间的变化。 图形技术和特定时间点的 p 值将用于识别任何观察到的变化的时间过程，例如，饮食干预可能多快导致所检查的措施出现差异。 将在 P<0.05 水平上确定显着性，并在适用的情况下对多重比较进行适当调整。 在脂质组学分析中，将设置 0.05 的错误发现率，并报告 FDR 校正的 P 值。 将使用 Pearson 相关系数检查特定信号测量（ERBB 水平）的变化与脂质种类（SM 和其他类别）的变化之间的线性关系。 分析将在 SAS 中进行。