Efeitos da intervenção da dieta mediterrânea na doença cardíaca diabética

Desenho do estudo: O estudo é um ensaio clínico intervencional randomizado, prospectivo, não cego, comparando o ModMeD à dieta cardíaca padrão em 48 (24 por braço) pacientes internados com DM tipo II agendados para CABG no MMC e que estão programados para permanecer no hospital para quatro (4) ou mais dias antes da cirurgia.

Embora não seja viável cegar os sujeitos ou os médicos, os investigadores de laboratório que processam amostras e analisam as respostas biológicas à intervenção serão cegos. Especificamente, as amostras de tecido serão desidentificadas e codificadas antes de serem transferidas para o laboratório.

Objetivo primário: determinar se uma dieta mediterrânea causa mudanças rápidas no conteúdo lipídico (conforme determinado por espectrometria de massa) e na atividade das células cardíacas (conforme determinado pelo nível de expressão de ERBB2) entre pacientes com TIIDM submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica no MMC.

Braços de estudo:

1. Cardiac DM Diet padrão (SCaDMD) durante a internação (antes e depois da cirurgia de revascularização miocárdica)
2. Dieta Mediterrânea (MedD) durante a internação (antes e depois da cirurgia de revascularização miocárdica)

Recrutamento de sujeitos: 48 adultos internados serão incluídos (idade ≥ 18 anos com diagnóstico de DM tipo II com nível de hemoglobina A1c maior que 7,5% e doença arterial coronariana com revascularização cirúrgica planejada (CABG)) no MMC. Outros critérios de inclusão incluem internação hospitalar pré-cirúrgica planejada de pelo menos 4 dias e vontade de ter o menu restrito da Dieta Mediterrânea durante a internação.

Processo de Consentimento Informado: Por meio de uma isenção parcial HIPAA aprovada pelo IRB, a equipe clínica fará a triagem de pacientes elegíveis que estão agendados para cirurgia de CABG. Os indivíduos elegíveis serão abordados por sua equipe clínica para avaliar o interesse na participação no estudo. Os pacientes que indicarem interesse serão abordados por um membro da equipe do estudo para explicar o estudo completamente e obter o consentimento informado. Os pacientes que assinarem o formulário de consentimento informado para esta pesquisa terão concordado em: 1) ter medidas corporais iniciais 2) ser randomizados para consumir uma dieta mediterrânea ou a dieta DM cardíaca padrão durante sua internação, 3) passar por um procedimento de biópsia no momento de sua cirurgia de revascularização miocárdica e doar tecido do miocárdio ventricular aproximadamente do tamanho de um grão de arroz, 4) doar tecido geralmente descartado durante a cirurgia (tecido do átrio direito cardíaco, músculo esquelético e gordura), 5) doar um total de 30 ml de sangue coletado em 3 momentos: antes, durante e 4 dias após a cirurgia de revascularização miocárdica, 6) para preencher questionários sobre seu consumo alimentar e 7) permitir a revisão de seu prontuário médico para informações de saúde cardiovascular. O consentimento informado incluirá responsabilidades detalhadas do paciente, como preencher o questionário dietético com precisão e aderir às restrições da dieta, incluindo a exigência de que as famílias dos pacientes não tragam alimentos de fora para os pacientes. Os pacientes interessados ​​e suas famílias terão ampla oportunidade de fazer perguntas.

Procedimentos de estudo

Questionário dietético: Após a obtenção do consentimento informado, todos os indivíduos preencherão um questionário dietético (DHQ II) fornecido a eles por um nutricionista registrado que trabalha nos andares de internação de cardiologia do MMC. O DHQ II é um questionário on-line de frequência alimentar desenvolvido pelo NIH (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about). O DHQI original foi desenvolvido pelo Risk Factor Assessment Branch e validado para mostrar que fornece estimativas razoáveis ​​de nutrientes 26-29. O DHQII é uma versão atualizada com mais 10 itens alimentares (134 em vez de 124) e 8 suplementos alimentares. O DHQII tem 4 versões que diferem em questões de tempo e tamanho da porção. Utilizaremos a opção de um mês (Apêndice A) que inclui o tamanho das porções. Trata-se de um questionário autoaplicável a ser preenchido pelo paciente que leva cerca de uma hora. Aos sujeitos será oferecida a versão online via tablet portátil ou uma versão em papel. Os dados do DHQII serão analisados ​​usando o programa de software Diet*Calc disponível gratuitamente no NCI (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/). Este programa gera estimativas de ingestão de nutrientes e grupos de alimentos para as versões padrão do DHQII usadas neste estudo. Os dados do questionário dietético nos permitirão conduzir uma série de análises exploratórias que não foram tentadas antes. Por exemplo, procuraremos associações entre a abundância de certas espécies lipídicas com a ingestão de gordura insaturada e saturada pelo paciente.

Antropometria de linha de base: Altura (m) e peso (kg) serão medidos usando equipamento clínico padrão e serão verificados por um membro da equipe de estudo. Esta informação será utilizada para calcular o índice de massa corporal (IMC), no momento da inscrição. Um membro da equipe de estudo também medirá a circunferência da cintura e do quadril.

Randomização: Depois que os indivíduos foram selecionados para elegibilidade e forneceram consentimento informado, eles serão randomizados em uma proporção de 1:1 para uma das duas intervenções dietéticas. A randomização será implementada pelo estatístico do estudo e envolverá a estratificação por sexo em blocos alternados de 4 e 6. O randomizador nQuery será usado para criar o esquema de randomização; a lista de randomização será transferida para envelopes selados, opacos e numerados sequencialmente, um conjunto para cada estrato. No momento da randomização, o próximo envelope numerado será aberto para determinar a designação do grupo de estudo. Os nutricionistas do estudo garantirão que as atribuições de dieta sejam comunicadas e seguidas.

Dieta Cardíaca Padrão para DM (SCaDMD): De acordo com as diretrizes nutricionais atuais, todos os indivíduos receberão instruções padrão e o menu dietético (Apêndice B) de nutricionistas do MMC. com base em seus diagnósticos de DM e doença coronariana. Os pacientes receberão uma dieta cardíaca, que é uma dieta com baixo teor de gordura e, se desejado pelo médico, restrições adicionais de sódio ou carboidratos podem ser incluídas caso a caso. Os nutricionistas do estudo supervisionarão o registro do consumo diário de alimentos desde a inscrição até o dia 4 após a cirurgia de revascularização miocárdica por 1) questionamento direto, 2) revisão dos pedidos de alimentos feitos pelo paciente e 3) exame das bandejas de alimentos após a conclusão das refeições.

Dieta Mediterrânea (MedD): Os nutricionistas registrados no MMC criaram um submenu (Apêndice C) do menu de internação MMC existente que é compatível com a dieta mediterrânea, conforme descrito por Casas et al. (2016)20 e foi utilizado no estudo PREDIMED. A única diferença entre a dieta mediterrânea utilizada neste estudo e a utilizada no estudo PREDIMED é a exclusão do vinho e do sofrito, molho utilizado como base na culinária espanhola, italiana, portuguesa e latino-americana. Isso se deu devido aos limites do refeitório do MMC. Após a randomização, os nutricionistas do estudo se reunirão com o sujeito para revisar o ModMeD e orientar sua seleção de alimentos. Os nutricionistas do estudo também se reunirão com enfermeiras para explicar a diferença entre a dieta padrão e a dieta mediterrânea e explicar os procedimentos do estudo para registrar o consumo de alimentos. Os nutricionistas do estudo supervisionarão o registro do consumo de alimentos diariamente desde a inscrição até o dia 4 após a cirurgia de CABG por 1) questionamento direto, 2) revisão dos pedidos de alimentos feitos pelo paciente e 3) exame das bandejas de alimentos após a conclusão das refeições.

Coleta de amostras biológicas: Tecido cardíaco ventricular, tecido cardíaco atrial e músculo esquelético intercostal serão coletados dos participantes do estudo durante a cirurgia de CABG. Amostras de sangue serão coletadas em três momentos: 1) na inscrição (no dia do questionário e das medidas antropomórficas), 2) no dia da cirurgia e 3) antes da alta hospitalar. Todas as amostras serão desidentificadas, codificadas, embaladas de acordo com os regulamentos da Categoria B e transportadas por correio para MMCRI. As amostras serão recebidas, registradas e processadas por pessoal de laboratório treinado. Qualquer excesso de tecido não utilizado para este estudo será armazenado e distribuído pelo BioBank para pesquisa não especificada se o consentimento do paciente tiver sido obtido para este fim.

Manuseio de amostras: As amostras de sangue serão deixadas em temperatura ambiente por 15 a 20 minutos e depois centrifugadas por 30 minutos. O sobrenadante (soro) será coletado e armazenado em gelo para transporte ao MMCRI. Realizamos testes para avaliar a estabilidade dos lipídios no soro sanguíneo e constatamos que os lipídios são estáveis ​​por até 3 horas em temperatura ambiente. Todos os tecidos serão congelados o mais rápido possível e transportados congelados em gelo seco para o MMCRI. Todas as amostras de soro e tecido serão armazenadas a -80ºC. A experiência mostra que as amostras permanecem inalteradas por mais de 1 ano nessas condições. A análise da amostra será realizada quando todas as amostras tiverem sido coletadas.

Tecido ventricular: ventrículo esquerdo anterior (VE), biópsias epicárdicas de parede livre (1,5 mm x 1,5-7 mm de profundidade/comprimento) serão obtidas de pacientes submetidos à cirurgia de bypass por seu cirurgião cardíaco no momento da cirurgia25,30. Especificamente, a biópsia será realizada após o início da perfusão de circulação extracorpórea e uma vez que a aorta foi pinçada e a cardioplegia administrada. Uma área aproximadamente do tamanho de um grão de arroz na superfície da parede anterior do ventrículo esquerdo livre de gordura epicárdica será escolhida para a biópsia. A biópsia será realizada em paralelo com outros procedimentos para preparar o paciente para enxertos e não aumentará o tempo total da cirurgia. O tecido será colocado em solução tampão fisiológica para isolamento celular ou extração de lipídeos para perfilação lipidômica. Os isolamentos celulares serão realizados o mais rápido possível após o recebimento do tecido no MMCRI. O tecido que será utilizado para extrações lipídicas pode ser congelado a -80ºC.

Tecido atrial: O tecido atrial virá do apêndice atrial direito (RAA) descartado durante a cirurgia. O tecido atrial é consideravelmente maior que a biópsia ventricular e nos permite subdividir cada amostra. Uma peça será colocada em tampão fisiológico para isolamento celular. Uma segunda peça será colocada em formalina e utilizada para imunofluorescência. O terceiro será armazenado em solução RNAlater® para estabilizar o RNA até a extração. A peça final será congelada para isolamento das frações cavéolas, perfis lipidômicos e protéicos e western blotting.

Tecido muscular intercostal esquelético: O músculo intercostal é removido durante a cirurgia para acessar a artéria mamária interna esquerda, que é usada para fornecer um enxerto de bypass. O músculo esquelético intercostal descartado será dividido em duas partes, uma congelada para isolamento das frações cavéolas, perfil lipidômico e proteico e western blotting, e a segunda colocada em formalina e usada para imunofluorescência, colocada em tampão fisiológico para isolamento celular, ou colocado em solução RNAlater® para estabilizar o RNA até a extração.

Sangue: Uma amostra de sangue basal será coletada por punção venosa uma vez antes da cirurgia (no dia da administração do questionário de dieta quando o paciente estiver recebendo coletas de sangue clinicamente indicadas diariamente) para avaliar a expressão de monócitos de CAV, bem como os perfis lipidômicos plasmáticos. Amostras de sangue de acompanhamento serão coletadas em outros dois momentos: no dia da cirurgia por meio de uma linha central e 4 dias após a cirurgia e antes da alta por punção venosa. As amostras de sangue serão coletadas em 2 tubos de 5 ml, um tubo de anticoagulante ACD (Acid Citrate Dextrose) e um tubo de SST com tampa vermelha e refrigerados ou processados ​​em 3h.

Coleta de dados: Os prontuários médicos dos participantes serão revisados ​​para abstrair dados demográficos e clínicos conforme especificado abaixo. A coleta de dados do paciente ocorrerá na inscrição e aproximadamente 1 mês após a cirurgia (por um máximo de três seis meses). Os dados serão inseridos em um banco de dados REDCap específico do estudo, compatível com HIPAA, juntamente com dados específicos da intervenção (dados do questionário, medições antropomórficas e informações sobre dieta). Esses dados, que incluem nomes de pacientes e outros identificadores, estarão acessíveis apenas a investigadores clínicos. Os dados laboratoriais serão mantidos separadamente. Os dados clínicos serão codificados e exportados para comparação com dados laboratoriais e análise sem outros identificadores pessoais. O link para o código estará acessível apenas para investigadores clínicos.

Informação pessoalmente identificável

1. Nome
2. Data de nascimento
3. Número do registro médico
4. Dia de internação
5. Data da cirurgia
6. Data de alta 7.7.2 Dados demográficos

1. Idade (anos) 2. Sexo (F/M) 3. Raça/etnia (categorias OMB) 4. Histórico de tabagismo (nunca/antigo/atual; se antigo/atual, maço anos) 7.7.2 Histórico médico

1. Data do diagnóstico
2. Níveis de HbA1c
3. Dados de perfil lipídico padrão 7.7.2 Informações sobre medicamentos no momento da inscrição

1. Medicação antidiabética (medicamentos, dose, frequência) 2. Medicação hipolipemiante (medicamentos, dose, frequência) 3. Medicação anti-hipertensora (medicamentos, dose, frequência) 7.7.3 Dados específicos do teste

1. Pontuações do questionário dietético para ingestão de nutrientes e grupos de alimentos
2. Medidas antropomórficas (altura, peso, IMC, circunferência do quadril e cintura)
3. Adesão à dieta diária (sim ou não; se não, qual alimento não estava em adesão)
4. Ingestão calórica diária
5. Peso durante a intervenção
6. Momento das aquisições de amostras de sangue
7. Dados de laboratório de pesquisa (dados de expressão de ERBB2, dados de lipidômica) 7.7.4 Os resultados clínicos

1. Medicações na alta 2. Morbidade pós-operatória e sobrevida 30 dias após a cirurgia

8.0 Procedimentos de Laboratório

8.1 Níveis de expressão de ERBB e outras proteínas: A expressão de ERBB2 na superfície celular em células endoteliais atriais será avaliada por citometria de fluxo. Além disso, os níveis de ERBB2, CAV1/3 e IRS-1 serão determinados por Western blot usando anticorpos específicos (CAV1: BD# 610058, camundongo ou sinalização celular; CAV3: BD# 610420, camundongo IRS-1: BD#611395 , rato. pY989-IRS-1: Santa Cruz, SC-17200-R, coelho, total ERBB2: Life Technologies. pERBB2/Tyr1248: Millipore, 06-229, em combinação com FITC conjugado com IgG anti-coelho de cabra, Abcam, ab6717). Os níveis de pAkt serão avaliados em monócitos circulantes coletados de sangue total, bem como em células endoteliais atriais e ventriculares isoladas.

Análise adicional de lipídios e proteínas: A composição lipídica das amostras plasmáticas de linha de base será comparada com a obtida das amostras de tecido atrial e ventricular correspondentes para avaliar o grau em que os lipídios circulantes em jejum representam o conteúdo tecidual.

Suspensões de células únicas não-miócitos serão preparadas a partir de tecido atrial usando digestão com colagenase II/Dispase II conforme descrito36. Os níveis de receptor ERBB e CAV1 e 2 em conjunto com marcadores específicos de células serão medidos por citometria de fluxo.

Considerações Estatísticas

Tamanho/poder da amostra: Dados piloto foram usados ​​para determinar os níveis prováveis ​​de várias medidas em nossa população de estudo e escolhemos um para usar para uma análise de poder, expressão de ERBB2 na superfície celular em células endoteliais atriais. Dados piloto usando citometria de fluxo baseada em fluorescência revelaram uma média de 9,56 e DP de 3,14 para esta medida em pacientes diabéticos (Fig. 3). Assim, o tamanho da amostra alvo de 24 pacientes em cada grupo de estudo permitirá a detecção de uma diferença de 2,64 nesta medida (hipótese de ser semelhante no grupo de controle aos nossos dados preliminares e maior no grupo de intervenção) com poder de 80% e um nível de significância de 0,05. As análises secundárias do conteúdo lipídico plasmático e da sinalização de monócitos serão análises de medidas repetidas, o que adicionará poder adicional, pois teremos várias observações por pessoa, e retirará algum poder, devido à necessidade de ajustar os valores de p para comparações múltiplas por ponto de tempo.

Análises: Esta será uma análise de intenção de tratar. O sucesso da randomização será avaliado comparando as características do paciente na linha de base usando proporções ou médias e DPs usando testes de qui-quadrado ou testes t de Student, conforme apropriado. Dentro das alterações do grupo (ou seja, escore delta) e entre as diferenças entre os grupos nas medidas tomadas em pontos temporais seriados (soro sanguíneo) serão analisadas por ANOVA de medidas repetidas de modelo misto; o modelo misto será necessário porque os pacientes provavelmente terão diferentes durações de exposição alimentar e, portanto, diferentes números de medidas repetidas. As variáveis ​​de interesse são o tempo, o grupo de tratamento e o tempo por interação do tratamento. Os resultados do modelo serão usados ​​para estimar os valores médios e mudar ao longo do tempo para comparações dentro do grupo e entre grupos. Técnicas gráficas e valores de p específicos do ponto de tempo serão usados ​​para identificar o curso do tempo de quaisquer mudanças observadas, por exemplo, a rapidez com que a intervenção dietética pode levar a diferenças nas medidas examinadas. A significância será identificada no nível P<0,05, com ajuste apropriado para comparações múltiplas quando aplicável. Nas análises lipidômicas, uma taxa de descoberta falsa de 0,05 será definida e os valores de P corrigidos por FDR serão relatados. A relação linear entre a mudança nas medidas específicas de sinalização (níveis de ERBB) e a mudança nas espécies lipídicas (SM e outras classes) será examinada usando o coeficiente de correlação de Pearson. A análise será realizada no SAS.