A mediterrán diéta beavatkozásának hatásai a diabéteszes szívbetegségben

A vizsgálat felépítése: A vizsgálat egy prospektív, nem vak, randomizált, intervenciós klinikai vizsgálat, amely a ModMeD-t a standard kardiális étrenddel hasonlítja össze 48 (karonként 24) II-es típusú DM-ben szenvedő betegen, akiket CABG-re terveztek az MMC-ben, és akiknek a tervek szerint kórházban kell maradniuk. négy (4) vagy több nappal a műtét előtt.

Bár az alanyok vagy a klinikusok megvakítása nem kivitelezhető, a mintákat feldolgozó és a beavatkozásra adott biológiai válaszokat elemző laboratóriumi kutatók vakok lesznek. Pontosabban, a szövetminták azonosítása és kódolása a laboratóriumba való továbbítás előtt megtörténik.

Elsődleges cél: Annak meghatározása, hogy a mediterrán étrend okoz-e gyors változásokat a lipidtartalomban (tömegspektrometriával meghatározott) és a szívsejt aktivitásban (az ERBB2 expressziós szint alapján meghatározott) TIIDM-ben szenvedő betegeknél, akiket MMC-n CABG műtéten esnek át.

Tanulmányi fegyverek:

1. Standard Cardiac DM diéta (SCaDMD) a fekvőbeteg-kezelés alatt (a CABG műtét előtt és után)
2. Mediterrán diéta (MedD) a fekvőbeteg-kezelés alatt (CABG műtét előtt és után)

Alanyok toborzása: 48 fekvőbeteg felnőtt (18 év feletti, II-es típusú DM-vel diagnosztizáltak, 7,5%-nál nagyobb hemoglobin-A1c-szinttel és koszorúér-betegségben, tervezett sebészi revascularisatióval (CABG)) be lesz vonva az MMC-be. A további felvételi kritériumok közé tartozik a tervezett legalább 4 napos műtét előtti kórházi tartózkodás, valamint a mediterrán diéta korlátozott menüjére való hajlandóság a fekvőbeteg-ellátás idejére.

Tájékozott hozzájárulási eljárás: Az IRB által jóváhagyott részleges HIPAA-mentesség révén a klinikai csapat kiszűri azokat a jogosult betegeket, akiknél CABG-műtétet terveznek. A jogosult alanyokat klinikai csapatuk felkeresi, hogy felmérje a vizsgálatban való részvétel iránti érdeklődést. Az érdeklődést jelző betegeket a vizsgálati csoport egyik tagja felkeresi, hogy teljes körűen elmagyarázza a vizsgálatot, és tájékozott beleegyezését kérje. Azok a betegek, akik aláírják a beleegyező nyilatkozatot ehhez a kutatáshoz, beleegyeznek, hogy: 1) kiindulási testméreteket végezzenek, 2) kórházi tartózkodásuk alatt véletlenszerűen besorolják a mediterrán diétát vagy a standard kardiális DM-diétát, 3) egyidejűleg biopsziás eljáráson esnek át. CABG-jükből, és körülbelül egy rizsszem méretű kamrai szívizomszövetet adományoznak, 4) a műtét során általában eldobott szövetet (szív jobb pitvari szövet, vázizom és zsír), 5) összesen 30 ml vért adományoznak 3 időpont: a CABG műtét előtt, alatt és 4 nappal azt követően, 6) kérdőíveket kell kitölteni az ételfogyasztásukkal kapcsolatban, és 7) lehetővé tenni a kórlapjuk áttekintését a szív- és érrendszeri egészséggel kapcsolatos információk tekintetében. A tájékoztatáson alapuló beleegyezés magában foglalja a betegek tételes kötelezettségeit, például az étrendi kérdőív pontos kitöltését és az étrendi korlátozások betartását, beleértve azt a követelményt, hogy a beteg családja ne vigyen kívülről élelmiszert a betegeknek. Az érdeklődő betegek és családtagjaik bőséges lehetőséget kapnak kérdések feltevésére.

Tanulmányi eljárások

Diétás kérdőív: A tájékozott beleegyezés megszerzése után minden alany ki kell töltenie egy diétás kérdőívet (DHQ II), amelyet az MMC kardiológiai fekvőbeteg emeletén dolgozó regisztrált dietetikus bocsát ki. A DHQ II egy online élelmiszer-gyakorisági kérdőív, amelyet az NIH készített (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/about). Az eredeti DHQI-t a Risk Factor Assessment Branch fejlesztette ki, és hitelesítette annak bizonyítására, hogy ésszerű tápanyagbecsléseket ad 26-29. A DHQII egy frissített változat 10 további élelmiszerrel (124 helyett 134) és 8 étrend-kiegészítővel. A DHQII-nek 4 verziója van, amelyek időkeret és adagméret szerint különböznek egymástól. Használjuk az egy hónapos opciót (A függelék), amely tartalmazza az adagméreteket. Ez egy önkitöltős kérdőív, amelyet a páciensnek kell kitöltenie, és körülbelül egy órát vesz igénybe. Az alanyok az online változatot hordozható táblagépen vagy papíralapú változatban kínálják. A DHQII adatok elemzése a Diet*Calc szoftverrel történik, amely ingyenesen elérhető az NCI-től (https://epi.grants.cancer.gov/dhq2/dietcalc/). Ez a program tápanyag- és élelmiszercsoport-beviteli becsléseket generál a tanulmányban használt DHQII szabványos verzióihoz. Az étrendi kérdőív adatai lehetővé teszik, hogy számos olyan feltáró elemzést végezhessünk, amelyekre korábban még nem volt kísérlet. Például összefüggéseket keresünk bizonyos lipidfajták bősége és a betegek telítetlen és telített zsírok bevitele között.

Kiindulási antropometria: A magasságot (m) és a súlyt (kg) standard klinikai berendezéssel mérik, és a vizsgálati csoport egyik tagja ellenőrzi. Ezt az információt a beiratkozáskor a testtömeg-index (BMI) kiszámításához használjuk fel. A vizsgálati csoport tagja a derék- és csípőkörfogatot is megméri.

Véletlenszerű besorolás: Miután az alanyokat átvizsgálták a jogosultság szempontjából, és megadták a beleegyezésüket, 1:1 arányban randomizálják őket két diétás beavatkozás valamelyikéhez. A véletlenszerűsítést a vizsgálati statisztikus hajtja végre, és a nemek szerinti rétegződést fogja tartalmazni váltakozó 4-es és 6-os blokkokban. nQuery randomizert használnak a randomizációs séma létrehozásához; a véletlenszerűsítési lista lezárt, átlátszatlan, sorszámozott borítékokba kerül, minden réteghez egy-egy készlet. A véletlenszerű besorolás időpontjában a következő sorszámozott borítékot nyitják ki a vizsgálati csoportok besorolásának meghatározásához. A tanulmányi dietetikusok gondoskodnak arról, hogy az étrenddel kapcsolatos feladatokat közöljék és betartsák.

Szabványos kardiális DM diéta (SCaDMD): A jelenlegi táplálkozási irányelvek szerint minden alany standard oktatást és étrendi menüt (B függelék) kap az MMC dietetikusától. DM és koszorúér-betegség diagnózisa alapján. A betegek szívdiétát írnak elő, amely zsírszegény étrend, és ha a kezelőorvos kívánja, eseti alapon további nátrium- vagy szénhidrát-korlátozást is beiktathatnak. A vizsgálati dietetikusok a felvételtől a CABG-műtétet követő 4. napig napi szinten felügyelik a rögzített élelmiszer-fogyasztás rögzítését 1) közvetlen kikérdezéssel, 2) a beteg által leadott ételrendelések áttekintésével, és 3) az étkezés befejezését követő ételtálcák vizsgálatával.

Mediterrán diéta (MedD): Az MMC regisztrált dietetikusai a meglévő MMC fekvőbeteg menüből egy almenüt (C melléklet) hoztak létre, amely megfelel a Casas és munkatársai által leírt mediterrán étrendnek. (2016)20, és a PREDIMED vizsgálatban használták. Az egyetlen különbség az ebben a tanulmányban használt mediterrán étrend és a PREDIMED kísérletben használt között a bor és a sofrito kizárása, amely szósz a spanyol, olasz, portugál és latin-amerikai konyha alapjául szolgál. Ez az MMC cafeteria korlátai miatt volt. A véletlen besorolást követően a dietetikusok találkoznak az alanyal, hogy áttekintsék a ModMeD-t, és irányítsák ételválasztásukat. A dietetikusok találkozni fognak padlóápolókkal is, hogy elmagyarázzák a standard étrend és a mediterrán étrend közötti különbséget, és elmagyarázzák az élelmiszer-fogyasztás rögzítésére szolgáló vizsgálati eljárásokat. A vizsgálati dietetikusok a beiratkozástól a CABG műtét utáni 4. napig napi szinten felügyelik az ételfogyasztás rögzítését 1) közvetlen kikérdezéssel, 2) a beteg által leadott ételrendelések áttekintésével, és 3) az étkezések befejezését követő ételtálcák vizsgálatával.

Biológiai mintagyűjtés: A kamrai szívszövetet, a pitvari szívszövetet és a váz-bordaközi izmokat gyűjtik a vizsgálatban résztvevőktől a CABG műtét során. Vérmintavétel három időpontban történik: 1) a beiratkozáskor (a kérdőív és az antropomorf mérések napján), 2) a műtét napján és 3) a kórházból való elbocsátás előtt. Minden mintát azonosítanak, kódolnak, csomagolnak a B kategóriás előírásoknak megfelelően, és futárral szállítják az MMCRI-hez. A mintákat képzett laboratóriumi személyzet fogadja, rögzíti és feldolgozza. A vizsgálathoz nem használt felesleges szöveteket a BioBank bankba helyezi és szétosztja nem meghatározott kutatási célokra, ha ehhez a beteg beleegyezését kapta.

Mintakezelés: A vérmintákat 15-20 percig szobahőmérsékleten hagyják, majd 30 percig centrifugálják. A felülúszót (szérumot) összegyűjtjük és jégen tároljuk, majd az MMCRI-be szállítjuk. Teszteket végeztünk a vérszérumban lévő lipidek stabilitásának értékelésére, és azt találtuk, hogy a lipidek szobahőmérsékleten legfeljebb 3 órán át stabilak. Az összes szövetet a lehető leghamarabb lefagyasztják, és szárazjégen fagyasztva szállítják az MMCRI-be. Minden szérum- és szövetmintát -80 °C-on kell tárolni. A tapasztalat azt mutatja, hogy ilyen körülmények között a minták több mint 1 évig változatlanok maradnak. A mintaelemzésre akkor kerül sor, ha az összes mintát összegyűjtötték.

Kamrai szövet: Bal kamrai elülső (LV), szabad falú epikardiális biopsziát (1,5 mm x 1,5-7 mm mély/hossz) vesz a szívsebész által a műtét idején bypass műtéten átesett betegektől25,30. Pontosabban, a biopsziát a cardiopulmonalis bypass perfúzió elindítása és az aorta szorítása és a cardioplegia beadása után kell elvégezni. A biopsziához körülbelül egy rizsszem nagyságú területet választanak ki a bal kamra elülső falának epikardiális zsírtól mentes felületén. A biopsziát más eljárásokkal párhuzamosan végzik, hogy felkészítsék a pácienst a graftokra, és ez nem növeli meg a teljes műtéti időt. A szövetet fiziológiás pufferoldatba helyezik a sejtek izolálásához vagy lipid extrakcióhoz a lipidomikus profilalkotáshoz. A sejtizolációt a lehető leghamarabb elvégzik, miután a szövetet megkapták az MMCRI-ben. A lipid extrakcióhoz használt szövet -80 °C-on lefagyasztható.

Pitvari szövet: A pitvari szövet a műtét során eldobott jobb pitvari függelékből (RAA) származik. A pitvari szövet lényegesen nagyobb, mint a kamrai biopszia, és lehetővé teszi az egyes minták felosztását. Egy darabot fiziológiás pufferbe helyezünk a sejtek izolálására. A második darabot formalinba helyezik, és immunfluoreszcenciára használják. A harmadikat RNAlater® oldatban tárolják, hogy az RNS-t az extrakcióig stabilizálja. Az utolsó darabot lefagyasztják a caveolae-frakciók izolálására, a lipid- és fehérjeprofil meghatározására, valamint a Western-blot-vizsgálatra.

Skeletális bordaközi izomszövet: A bordaközi izmokat műtét során távolítják el, hogy hozzáférjenek a bal belső emlőartériához, amelyet bypass graft készítésére használnak. Az eldobott bordaközi vázizmot két részre osztják, az egyiket lefagyasztják a caveolae-frakciók izolálására, a lipidomikus és fehérjeprofilok meghatározására, valamint a Western-blot-vizsgálatra, a másikat pedig vagy formalinba helyezik, és immunfluoreszcenciára használják, fiziológiás pufferbe helyezik a sejtizolációhoz, vagy RNAlater® oldatba helyezzük az RNS stabilizálására az extrakcióig.

Vér: Kiindulási vérmintát vesznek vénapunkcióval egyszer a műtét előtt (a diétás kérdőív beadásának napján, amikor a beteg napi klinikailag indikált vérvételen vesz részt), hogy értékelje a CAV monocita expresszióját, valamint a plazma lipidom profilját. Az utóellenőrző vérminta két másik időpontban történik: a műtét napján egy központi vezetéken és 4 nappal a műtét után, valamint a vénapusztuláson keresztül történő elbocsátás előtt. A vérmintákat 2 db 5 ml-es csőbe, egy ACD (Sav Citrate Dextrose) antikoaguláns csőbe és egy piros kupakú SST csőbe gyűjtik, majd 3 órán belül lehűtik vagy feldolgozzák.

Adatgyűjtés: A résztvevők egészségügyi feljegyzéseit felülvizsgálják a demográfiai és klinikai adatok kivonatának érdekében, az alábbiak szerint. A betegadatok gyűjtése a beiratkozáskor és körülbelül 1 hónappal a műtét után történik (legfeljebb három hat hónapig). Az adatok egy vizsgálatspecifikus, HIPAA-kompatibilis REDCap adatbázisba kerülnek, a beavatkozás-specifikus adatokkal együtt (kérdőíves adatok, antropomorf mérések és étrendi információk). Ezek az adatok, amelyek magukban foglalják a betegek nevét és egyéb azonosítóit, csak a klinikai kutatók számára lesznek hozzáférhetők. A laboratóriumi adatokat külön kezeljük. A klinikai adatokat kódoljuk és exportáljuk a laboratóriumi adatokkal való összevetés és elemzés céljából, egyéb személyazonosítók nélkül. A kódra mutató hivatkozás csak klinikai kutatók számára lesz hozzáférhető.

Személyazonosításra alkalmas adatok

1. Név
2. Születési dátum
3. Orvosi jegyzőkönyv száma
4. A kórházi felvétel napja
5. A műtét időpontja
6. A mentesítés időpontja 7.7.2 Demográfiai adatok

1. Életkor (év) 2. Nem (F/M) 3. Faj/Etnikai hovatartozás (OMB kategóriák) 4. Dohányzás előzményei (soha/volt/jelenlegi; ha volt/jelenlegi, csomagévek) 7.7.2 Kórtörténet

1. A diagnózis dátuma
2. HbA1c szint
3. Szabványos lipidprofil adatok 7.7.2 Gyógyszerinformáció a beiratkozáskor

1. Cukorbetegség elleni gyógyszeres kezelés (gyógyszerek, dózis, gyakoriság) 2. Lipidcsökkentő gyógyszer (gyógyszerek, dózis, gyakoriság) 3. Vérnyomáscsökkentő gyógyszer (gyógyszerek, dózis, gyakoriság) 7.7.3 Próbaspecifikus adatok

1. Étrendi kérdőív pontszámai a tápanyag- és élelmiszercsoport-bevitelre vonatkozóan
2. Antropomorf mérések (magasság, súly, BMI, csípő- és derékbőség)
3. Napi étrend betartása (igen vagy nem; ha nem, melyik élelmiszer nem volt betartva)
4. Napi kalóriabevitel
5. Súly a beavatkozás során
6. A vérminta beszerzésének időpontja
7. Kutatólaboratóriumi adatok (ERBB2 expressziós adatok, lipidomikai adatok) 7.7.4 Klinikai eredmények

1. Gyógyszerek kibocsátáskor 2. Posztoperatív morbiditás és túlélés a műtét után 30 nappal

8.0 Laboratóriumi eljárások

8.1 Az ERBB és más fehérjék expressziós szintjei: A pitvari endothel sejtekben a sejtfelszíni ERBB2 expressziót áramlási citometriával kell értékelni. Ezenkívül az ERBB2, CAV1/3 és IRS-1 szintjét Western-blot-vizsgálattal határozzák meg specifikus antitestek (CAV1: BD# 610058, egér vagy sejtjelzés; CAV3: BD# 610420, egér IRS-1: BD#611395) segítségével. , egér. pY989-IRS-1: Santa Cruz, SC-17200-R, nyúl, összesen ERBB2: Life Technologies. pERBB2/Tyr1248: Millipore, 06-229, kombinálva kecske anti-nyúl IgG konjugált FITC-vel, Abcam, ab6717). A pAkt-szinteket a teljes vérből gyűjtött keringő monocitákban, valamint izolált pitvari és kamrai endotélsejtekben értékelik.

Kiegészítő lipid- és fehérjeanalízis: Az alapvonal plazmaminták lipidösszetételét összehasonlítjuk a megfelelő pitvari és kamrai szövetmintákból nyert lipidösszetétellel annak megállapítására, hogy az éhgyomri keringő lipidek milyen mértékben képviselik a szövettartalmat.

A pitvari szövetből nem miocita egysejt-szuszpenziót készítünk kollagenáz II/Dispase II emésztéssel a leírtak szerint36. Az ERBB receptor és a CAV1 és 2 szintjeit sejtspecifikus markerekkel együtt áramlási citometriával mérjük.

Statisztikai megfontolások

Mintaméret/teljesítmény: Kísérleti adatokat használtunk a vizsgálati populációnkban számos mérés valószínű szintjének meghatározására, és kiválasztottunk egyet, amelyet a pitvari endotélsejtek sejtfelszíni ERBB2 expressziójának teljesítményanalíziséhez használunk. A fluoreszcencia alapú áramlási citometriával végzett kísérleti adatok 9,56-os átlagot és 3,14-es SD-t mutattak erre a mértékre cukorbetegeknél (3. ábra). Így az egyes vizsgálati csoportokban 24 betegből álló célminta lehetővé teszi a 2,64-es eltérés kimutatását ebben a mérőszámban (a feltételezések szerint a kontrollcsoportban hasonló az előzetes adatainkhoz, és magasabb az intervenciós csoportban), 80%-os teljesítménnyel és szignifikancia szintje 0,05. A plazma lipidtartalmának és a monocita jelátvitelének másodlagos elemzése ismételt mérési analízis lesz, amely további teljesítményt ad, mivel személyenként több megfigyelésünk lesz, és elveszíti az erőt, mivel szükség van a p értékek beállítására a többszöri összehasonlításhoz időpontonként.

Elemzések: Ez a kezelési szándék elemzése lesz. A randomizálás sikerét úgy kell értékelni, hogy a betegek kiindulási jellemzőit arányok vagy átlagok és SD-k összehasonlításával khi-négyzet tesztekkel vagy Student-féle t-tesztekkel hasonlítják össze. A csoporton belüli változások (pl. delta pontszám) és a csoportok közötti különbségeket a sorozatos időpontokban végzett mérésekben (vérszérum) vegyes modellel, ismételt mérésekkel, ANOVA-val elemezzük; a vegyes modellre azért lesz szükség, mert a betegek valószínűleg eltérő időtartamú étrendi expozíciót kapnak, és ezért eltérő számú ismételt mérést tesznek. Az érdeklődésre számot tartó változók az idő, a kezelési csoport és a kezelési interakciók időpontja. A modell eredményeit az átlagértékek és az időbeli változás becslésére használják fel a csoporton belüli és a csoportok közötti összehasonlításhoz. Grafikus technikákat és időpont-specifikus p értékeket használunk a megfigyelt változások időbeli lefolyásának azonosítására, például arra, hogy az étrendi beavatkozás milyen gyorsan vezethet eltérésekhez a vizsgált intézkedésekben. A szignifikancia meghatározása P<0,05 szinten történik, adott esetben többszörös összehasonlításhoz megfelelő korrekcióval. A lipidomikus analízisben 0,05-ös hamis felfedezési arányt állítanak be, és az FDR-korrigált P értékeket jelentik. A specifikus jelátviteli mértékek (ERBB szintek) változása és a lipidfajták változása (SM és más osztályok) közötti lineáris összefüggést a Pearson-féle korrelációs együttható segítségével vizsgáljuk. Az elemzés a SAS-ban történik.