miR-142-3p 作为 MS 突触病变的潜在生物标志物

在过去十年中，结构和功能性突触改变（统称为突触病变）已成为导致多发性硬化症 (MS) 及其小鼠模型实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 神经退行性损伤的决定性病理过程。 由于突触改变和丢失是可逆的，与神经元丢失不同，早期检测可以允许早熟的临床干预并可能获得更好的治疗结果，但可靠的生物标志物尚不可用。

在脑脊液 (CSF) 中循环的 MicroRNA (miR) 是作为 MS 突触病驱动的疾病进展的可能敏感生物标志物的良好候选者。 它们代表了一类新的基因表达调节剂，在体液中稳定存在，在许多生理和病理过程中起着关键作用，尤其是在中枢神经系统中。 因此，最近已经证明，miR-142-3p 是 EAE/MS 兴奋性毒性突触功能障碍的有害调节轴的关键成分，通过降低神经胶质谷氨酸天冬氨酸转运蛋白/兴奋性氨基酸转运蛋白 1 (GLAST/EAAT1) 的水平） 蛋白质。 此外，复发缓解型多发性硬化症 (RRMS) 患者的 EAE 大脑和 CSF 中的 miR-142-3p 水平升高，并且与疾病进展相关。 初步数据还表明，miR-142-3p 是 MS 不同药物治疗的直接靶标，而非药物治疗的作用，如治疗性经颅磁刺激 (TMS) 改善 MS 痉挛状态，仍然未知。

基于这些考虑，将进行一项为期约 6 年的前瞻性和回顾性队列研究，以评估 miR-142-3p 是否是 MS 突触驱动疾病进展 (AIM1) 和疾病改善治疗功效的可能生物标志物（ DMTs) 目前用于 MS 治疗 (AIM2a)。 此外，将对外周血进行遗传筛查，以确定与 MS 突触病 (AIM2b) 相关的 miR-142-3p 和 GLAST/EAAT1 基因的编码和/或调节区域中的单核苷酸多态性 (SNP)。 最后，重复 TMS 刺激方案 (iTBS) 将在筛选的下肢痉挛 MS 患者亚组（介入子研究）中执行，以评估患者对与已识别 SNP (AIM2c) 相关的治疗的反应。

鉴于 MS 疾病的异质性和复杂性，多变量方法将允许剖析 miR-142-3p 对受突触病变影响的 MS 病程的贡献 (AIM1)。

首先，MS CSF 中的 miR-142-3p 水平（招募当天，T0）将与其他可能与疾病进展相关的变量相关，例如：

• 临床（疾病持续时间，估计为从发病到最近一次残疾评估的年数；残疾，使用 EDSS = 扩展残疾状态量表进行评估；进展指数，PI = EDSS/疾病持续时间；ARR 的变化 = 年化复发率）和神经放射学参数（双回波质子密度；FLAIR = 液体衰减反转恢复；T2-WI = T2 加权自旋回波图像和 T1-WI = 静脉注射后对比前和对比后 T1 加权自旋回波图像如果没有复发（T12、T24、T36、T48、T60、T72），则在 T0 和 6 年随访期间每年一次（T12、T24、T36、T48、T60、T72）输注钆（Gd）；
• CSF (T0) 中炎症和潜在兴奋性毒性蛋白因子（如 IL-1β、TNF 和 RANTES-CCL5）的水平；
• CSF 中神经丝、β 淀粉样蛋白、tau 蛋白和生长因子（如 NGF、PDGF 和 BDNF）的水平，作为 CSF 停药 (T0) 时发生的神经退行性和再生过程的可能指标。

为了减少变量维度，将应用主成分分析 (PCA)，同时考虑到 miR-142-3p 作为 CSF 中循环的复杂分子网络的一部分对疾病进展的贡献，并且将重复单变量和多变量相关性.

在多变量分析（基于多变量广义线性模型，GLM）中，CSF 中的 miR-142-3p 水平（或 PCA 成分，包括 miR-142-3p 作为成分的一部分）将被视为调整人口统计学的自变量，临床和神经放射学价值以及不同的 DMT 治疗。 将尝试根据患者的治疗分层进行进一步分析 (AIM2a)。

最后，确定与疾病进展变量相关的 miR-142-3p（或包括 miR-142-3p 的 PCA 成分）的 CSF 水平将与神经生理学参数相关，通过 TMS 记录以评估皮质兴奋性和可塑性（SICI =短间隔皮质内抑制；ICF = 皮质内促进；LICI = 长间隔皮质内抑制；PAS = 配对联想刺激）在 T0 的 MS 患者中。因此，在 CSF 中循环的 miR-142-3p 将被验证为突触驱动疾病进展的可能生物标志物（作为单个分子或作为 PCA 成分的一部分）。

为了鉴定与 MS 突触病 (AIM2b) 相关的 miR-142-3p 和 GLAST/EAAT1 编码基因的遗传变异，将在 T0 分析 SNP，并将与 CSF 中的 miR-142-3p 水平以及与疾病进展如 AIM1。 PCA 和 GLM 模型将在 AIM1 中应用。

根据为期两周的 iTBS 减少下肢痉挛方案、比目鱼肌 H 反射的 H/M 振幅比和改良 Ashworth 量表 (MAS)，评估介入亚组中筛选的 MS 患者亚组的治疗反应性将在刺激方案之前 (W0) 和之后 (W2) 进行考虑。 将评估患者对 iTBS 刺激方案的反应与特定 SNP 之间的可能关联 (AIM2c)。

将使用 Prism GraphPad 6.0、IBM SPSS Statistics 15.0、R 软件和 T-MEV 4.4.1 进行统计分析。 将通过 Kolmogorov-Smirnov 和 Shapiro-Wilk 检验对数据进行正态分布检验。 k-means 方法将用于根据 CSF 中的 miR-142-3p 水平和其他相关参数将 MS 患者分成同质簇。 两组之间的差异将酌情使用学生 t 检验、Mann-Whitney 检验、Fisher 精确检验或对数秩检验进行分析；多重比较将由 ANOVA 执行，然后由 Tukey HSD 或 Kruskal-Wallis 执行。 将执行 Pearson 或非参数 Spearman 相关系数，以评估 CSF 中 miR-142-3p 水平或 MIR142 和 SLC1A3 的特定遗传变异（或相应的 PCA 成分，见下文）与连续人口统计学、临床和神经放射学参数的关联（例如年龄、EDSS 的变化、T2 病变的数量等）。 对于多重比较，将应用 Benjamini 和 Hochberg 提出的方法来控制错误发现率 (FDR)。

PCA 将用于表示潜在相关变量集（miR-142-3p 的 CSF 水平或 MIR142 和 SLC1A3 的特定遗传变异、炎症和潜在的兴奋性毒性蛋白因子以及神经丝、β 淀粉样蛋白、tau 蛋白和生长因子的水平）使用正交变换获得的线性不相关的主成分 (PC)。 对 PC 进行排序，以便第一台 PC 具有最大可能的方差，并且仅选择一些组件来表示相关变量。 结果，变量的维数减少了。

为了验证 miR-142-3p 作为突触驱动疾病进展的生物标志物（根据临床或放射学变化和 TMS 变量测量）或与 MS 突触相关的 MIR142 和 SLC1A3 的特定 SNP，将应用 GLM 模型，分别考虑CSF 中的 miR-142-3p 水平（或已识别的 PCA 成分，包括 miR）或遗传变异作为调整人口统计学、临床、神经放射学、神经生理学、生化因素和治疗的独立变量。

数据将显示为平均值（标准差，sd）或中位数（第 25-75 个百分位）。 显着性水平确定为 p<0.05。