miR-142-3p jako potenciální biomarker synaptopatie u RS

V posledním desetiletí se strukturální a funkční synaptické změny, souhrnně známé jako synaptopatie, objevily jako determinantní patologický proces přispívající k neurodegenerativnímu poškození u roztroušené sklerózy (RS) a jejího myšího modelu, experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE). Protože synaptické změny a ztráty jsou reverzibilní, na rozdíl od ztráty neuronů, včasná detekce by mohla umožnit předčasný klinický zásah s potenciálně lepšími terapeutickými výsledky, ale spolehlivé biomarkery zatím nejsou k dispozici.

MikroRNA (miRs) cirkulující v mozkomíšním moku (CSF) jsou dobrými kandidáty jako možné citlivé biomarkery pro progresi onemocnění řízenou MS synaptopatií. Představují novou třídu modulátorů genové exprese se stabilní přítomností v tělesných tekutinách a s kritickou rolí v mnoha fyziologických a patologických procesech, zejména v centrálním nervovém systému. V souladu s tím bylo nedávno prokázáno, že miR-142-3p je klíčovou složkou škodlivé regulační osy EAE/MS excitotoxických synaptických dysfunkcí snížením hladiny gliálního glutamátaspartátového transportéru/transportéru excitačních aminokyselin 1 (GLAST/EAAT1 ) bílkoviny. Kromě toho jsou hladiny miR-142-3p zvýšené jak v EAE mozcích, tak v CSF pacientů s relaps-remitující MS (RRMS) a korelují s progresí onemocnění. Předběžná data také ukazují, že miR-142-3p je přímým cílem různých farmakologických způsobů léčby RS, zatímco účinek nefarmakologické léčby, jako je terapeutická transkraniální magnetická stimulace (TMS) ke zlepšení spasticity RS, je stále neznámý.

Na základě těchto úvah bude provedena prospektivní a retrospektivní kohortová studie trvající přibližně šest let, aby se posoudilo, zda je miR-142-3p možným biomarkerem pro progresi onemocnění řízenou MS synaptopatií (AIM1) a pro účinnost léčby modifikující onemocnění ( DMT) v současnosti používané v terapii RS (AIM2a). Kromě toho bude proveden genetický screening z periferní krve za účelem identifikace jednonukleotidových polymorfismů (SNP) v kódujících a/nebo regulačních oblastech genů miR-142-3p a GLAST/EAAT1 spojených s MS synaptopatií (AIM2b). Nakonec bude proveden protokol opakované stimulace TMS (iTBS) v podskupině vyšetřených pacientů s RS se spasticitou dolních končetin (intervenční podstudie), aby se vyhodnotila schopnost pacienta reagovat na léčbu spojenou s identifikovanými SNP (AIM2c).

Vzhledem k heterogenitě a komplexnosti onemocnění RS umožní multivariabilní přístup rozebrat příspěvek miR-142-3p k průběhu RS ovlivněném synaptopatií (AIM1).

Za prvé, hladiny miR-142-3p v MS CSF (den náboru, T0) budou korelovány s dalšími možnými proměnnými relevantními pro progresi onemocnění, jako jsou:

• klinické (doba trvání onemocnění, odhadovaná jako počet let od začátku do posledního posouzení invalidity; postižení, hodnoceno pomocí EDSS = Expanded Disability Status Scale; Index progrese, PI = EDSS/délka onemocnění; změna ARR = Anualized Relapse Rate) a neuroradiologické parametry (duální echo protonová hustota; FLAIR = tekutinou atenuované inverzní zotavení; T2-WI = T2 vážené spin echo snímky a T1-WI = předkontrastní a postkontrastní T1 vážené spinové echo snímky po intravenózním podání infuze gadolinia (Gd) v T0 a jednou ročně během 6letého sledování, pokud nedojde k relapsu (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• hladiny zánětlivých a potenciálních excitotoxických proteinových faktorů (jako IL-lp, TNF a RANTES-CCL5) v CSF (TO);
• hladiny neurofilament, beta amyloidu, tau proteinů a růstových faktorů (jako NGF, PDGF a BDNF) v mozkomíšním moku, jako možné indikátory neurodegenerativních a regeneračních procesů vyskytujících se při vysazení CSF (T0).

Pro snížení variabilní dimenze bude použita analýza hlavních komponent (PCA) s přihlédnutím k příspěvku miR-142-3p k progresi onemocnění jako součásti komplexní sítě molekul cirkulujících v CSF a budou se opakovat korelace univariable a multivariabilní. .

V multivariabilní analýze (založené na multivariabilních zobecněných lineárních modelech, GLM) budou hladiny miR-142-3p v CSF (nebo komponenty PCA včetně miR-142-3p jako součásti komponenty) považovány za nezávislé proměnné upravující demografické, klinické a neuroradiologické hodnoty, stejně jako různé DMT léčby. Bude provedena další analýza založená na stratifikaci léčby pacientů (AIM2a).

A konečně, hladiny miR-142-3p (nebo složek PCA včetně miR-142-3p) v CSF identifikované jako asociované s proměnnými progrese onemocnění budou korelovány s neurofyziologickými parametry, zaznamenanými pomocí TMS pro hodnocení kortikální excitability a plasticity (SICI = krátkodobá intrakortikální inhibice; ICF = intrakortikální facilitace; LICI = intrakortikální inhibice s dlouhým intervalem; PAS = párová asociativní stimulace) u pacientů s RS v T0. MiR-142-3p cirkulující v mozkomíšním moku bude tedy validován jako možné biomarkery progrese onemocnění řízené synaptopatií (jako jednotlivé molekuly nebo jako součást složky PCA).

K identifikaci genetických variant miR-142-3p a GLAST/EAAT1 kódujících genů relevantních pro MS synaptopatii (AIM2b) budou SNP analyzovány v T0 a budou korelovány s hladinami miR-142-3p v CSF a s dalšími možnými proměnnými relevantními pro progrese onemocnění jako u AIM1. PCA a GLM modely budou aplikovány jako v AIM1.

K vyhodnocení schopnosti reagovat na léčbu v podskupině vyšetřovaných pacientů s RS zahrnutých do intervenční podstudie na základě dvoutýdenního protokolu iTBS pro snížení spasticity dolních končetin, poměru amplitudy H/M reflexu Soleus H a modifikované Ashworthovy škály (MAS) bude zvažována před (W0) a po (W2) stimulačním protokolem. Bude posouzena možná souvislost mezi reakcí pacienta na stimulační protokol iTBS a specifickými SNP (AIM2c).

Statistická analýza bude provedena pomocí Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, R software a T-MEV 4.4.1. Data budou testována na distribuci normality pomocí Kolmogorov-Smirnovových a Shapiro-Wilkových testů. Metoda k-means bude použita k rozdělení pacientů s RS do homogenních shluků na základě hladin miR-142-3p v CSF a dalších relevantních parametrů. Rozdíly mezi dvěma skupinami budou podle potřeby analyzovány pomocí Studentova t-testu, Mann-Whitneyho testu, Fisherova exaktního testu nebo log-rank testu; vícenásobná srovnání budou provedena pomocí ANOVA následované Tukey HSD nebo Kruskal-Wallis. Pearsonovy nebo neparametrické Spearmanovy korelační koeficienty budou provedeny k vyhodnocení asociace hladin miR-142-3p v CSF nebo specifických genetických variantách MIR142 a SLC1A3 (nebo odpovídající PCA komponentě, viz dále) s kontinuálními demografickými, klinickými a neuroradiologickými parametry ( věk, změny EDSS, počet lézí T2 atd.). Pro vícenásobná srovnání bude řízena míra falešného zjišťování (FDR) za použití metody navržené Benjaminim a Hochbergem.

PCA bude aplikována k reprezentaci souborů potenciálně korelovaných proměnných (hladiny CSF miR-142-3p nebo specifické genetické varianty MIR142 a SLC1A3, zánětlivé a potenciální excitotoxické proteinové faktory a hladiny neurofilament, beta amyloid, tau protein a růstové faktory) s hlavní složky (PC), které jsou lineárně nekorelované, získané pomocí ortogonální transformace. PC jsou seřazeny tak, že první PC má největší možný rozptyl a jsou vybrány pouze některé komponenty, které reprezentují korelované proměnné. V důsledku toho se zmenšuje rozměr proměnných.

Pro ověření miR-142-3p jako biomarkeru progrese onemocnění řízené synaptopatií (měřeno z hlediska klinických nebo radiologických změn a proměnných TMS) nebo specifických SNP MIR142 a SLC1A3 spojených s MS synaptopatií budou použity modely GLM s ohledem na hladina miR-142-3p v CSF (nebo identifikované komponenty PCA včetně miR) nebo genetické varianty jako nezávislá proměnná přizpůsobující se demografickým, klinickým, neuroradiologickým, neurofyziologickým, biochemickým faktorům a léčbě.

Data budou prezentována jako průměr (směrodatná odchylka, sd) nebo medián (25.-75. percentil). Hladina významnosti je stanovena na p<0,05.