miR-142-3p jako potencjalny biomarker synaptopatii w SM

W ostatnim dziesięcioleciu, strukturalne i funkcjonalne zmiany synaptyczne, wspólnie znane jako synaptopatia, pojawiły się jako determinujący proces patologiczny przyczyniający się do uszkodzeń neurodegeneracyjnych w stwardnieniu rozsianym (MS) i jego mysim modelu, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE). Ponieważ zmiany i utrata synaps są odwracalne, w przeciwieństwie do utraty neuronów, wczesne wykrycie może pozwolić na przedwczesną interwencję kliniczną z potencjalnie lepszymi wynikami terapeutycznymi, ale wiarygodne biomarkery nie są jeszcze dostępne.

MikroRNA (miR) krążące w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) są dobrymi kandydatami na możliwe czułe biomarkery progresji choroby wywołanej synaptopatią SM. Reprezentują nową klasę modulatorów ekspresji genów, które są stale obecne w płynach ustrojowych i odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym. W związku z tym niedawno wykazano, że miR-142-3p jest kluczowym składnikiem szkodliwej osi regulacyjnej ekscytotoksycznych dysfunkcji synaptycznych EAE/MS, poprzez zmniejszenie poziomu glejowego transportera asparaginianu glutaminianu/pobudzającego transportera aminokwasów 1 (GLAST/EAAT1 ) białko. Ponadto poziomy miR-142-3p są zwiększone zarówno w mózgach EAE, jak iw płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z rzutowo-remisyjną postacią SM (RRMS) i korelują z postępem choroby. Wstępne dane ujawniają również, że miR-142-3p jest bezpośrednim celem różnych terapii farmakologicznych SM, podczas gdy działanie terapii niefarmakologicznych, takich jak terapeutyczna przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS) w celu złagodzenia spastyczności SM, jest nadal nieznane.

Na podstawie tych rozważań zostanie przeprowadzone prospektywne i retrospektywne badanie kohortowe trwające około sześciu lat, aby ocenić, czy miR-142-3p jest możliwym biomarkerem progresji choroby wywołanej synaptopatią stwardnienia rozsianego (AIM1) oraz skuteczności leczenia modyfikującego przebieg choroby ( DMT) obecnie stosowane w terapii SM (AIM2a). Ponadto zostanie przeprowadzony genetyczny skrining krwi obwodowej w celu identyfikacji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) w regionach kodujących i/lub regulujących genów miR-142-3p i GLAST/EAAT1, związanych z synaptopatią SM (AIM2b). Na koniec zostanie przeprowadzony protokół powtarzalnej stymulacji TMS (iTBS) w podgrupie przebadanych pacjentów ze stwardnieniem rozsianym ze spastycznością kończyn dolnych (podbadanie interwencyjne) w celu oceny odpowiedzi pacjenta na leczenie związane ze zidentyfikowanymi SNP (AIM2c).

Biorąc pod uwagę heterogeniczność i złożoność choroby stwardnienia rozsianego, podejście wielowymiarowe pozwoli przeanalizować udział miR-142-3p w przebiegu stwardnienia rozsianego, na który ma wpływ synaptopatia (AIM1).

Po pierwsze, poziomy miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym stwardnienia rozsianego (dzień rekrutacji, T0) zostaną skorelowane z innymi możliwymi zmiennymi istotnymi dla progresji choroby, takimi jak:

• kliniczny (czas trwania choroby, szacowany jako liczba lat od początku do ostatniej oceny niepełnosprawności; niepełnosprawność oceniana za pomocą EDSS = Expanded Disability Status Scale; Progression Index, PI = EDSS/czas trwania choroby; zmiana w ARR = roczna stopa nawrotów) i parametry neuroradiologiczne (gęstość protonów z podwójnym echem; FLAIR = rekonwalescencja osłabiona płynem; T2-WI = obrazy echa spinowego zależne od T2 i T1-WI = obrazy echa spinowego zależne od T1 przed i po podaniu kontrastu po podaniu dożylnym wlew gadolinu (Gd)) w T0 i raz w roku podczas 6-letniej obserwacji, jeśli nie wystąpił nawrót (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• poziomy zapalnych i potencjalnie ekscytotoksycznych czynników białkowych (jak IL-1β, TNF i RANTES-CCL5) w płynie mózgowo-rdzeniowym (T0);
• poziom neurofilamentów, beta amyloidu, białek tau i czynników wzrostu (takich jak NGF, PDGF i BDNF) w płynie mózgowo-rdzeniowym, jako możliwych wskaźników procesów neurodegeneracyjnych i regeneracyjnych zachodzących przy odstawieniu płynu mózgowo-rdzeniowego (T0).

Aby zredukować wymiar zmienny, zostanie zastosowana analiza głównych składowych (PCA) uwzględniająca udział miR-142-3p w progresji choroby jako część złożonej sieci cząsteczek krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym, a korelacje jedno- i wielowymiarowe zostaną powtórzone .

W analizie wielu zmiennych (opartej na uogólnionych modelach liniowych wielu zmiennych, GLM) poziomy miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym (lub składnikach PCA, w tym miR-142-3p jako część składnika) będą uważane za zmienną niezależną dostosowaną do czynników demograficznych, wartości kliniczne i neuroradiologiczne, jak również różne metody leczenia DMT. Podjęta zostanie dalsza analiza oparta na stratyfikacji leczenia pacjentów (AIM2a).

Wreszcie, poziomy miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym (lub składników PCA, w tym miR-142-3p) zidentyfikowane jako powiązane ze zmiennymi progresji choroby, zostaną skorelowane z parametrami neurofizjologicznymi, zarejestrowanymi za pomocą TMS w celu oceny pobudliwości i plastyczności kory mózgowej (SICI = hamowanie wewnątrzkorowe w krótkich odstępach czasu; ICF = torowanie wewnątrzkorowe; LICI = hamowanie śródkorowe w długich odstępach czasu; PAS = sparowana stymulacja asocjacyjna) u pacjentów z SM w T0. W ten sposób miR-142-3p krążący w płynie mózgowo-rdzeniowym zostanie zweryfikowany jako możliwy biomarker progresji choroby wywołanej synaptopatią (jako pojedyncze cząsteczki lub jako część składnika PCA).

Aby zidentyfikować warianty genetyczne genów kodujących miR-142-3p i GLAST/EAAT1 istotne dla synaptopatii SM (AIM2b), SNP zostaną przeanalizowane w T0 i zostaną skorelowane z poziomami miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz z innymi możliwymi zmiennymi istotnymi dla progresja choroby jak w AIM1. Modele PCA i GLM będą stosowane jak w AIM1.

Ocena odpowiedzi na leczenie w podgrupie przesiewowych pacjentów z SM włączonych do podbadania interwencyjnego na podstawie dwutygodniowego protokołu iTBS w celu zmniejszenia spastyczności kończyn dolnych, stosunku amplitudy H/M odruchu Soleus H oraz zmodyfikowanej skali Ashwortha (MAS) zostaną rozważone przed (W0) i po (W2) protokole stymulacji. Oceniony zostanie możliwy związek między reakcją pacjenta na protokół stymulacji iTBS a specyficznymi SNP (AIM2c).

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, oprogramowania R i T-MEV 4.4.1. Dane zostaną przetestowane pod kątem rozkładu normalności za pomocą testów Kołmogorowa-Smirnowa i Shapiro-Wilka. Metoda k-średnich zostanie wykorzystana do podzielenia pacjentów ze stwardnieniem rozsianym na jednorodne grupy, w oparciu o poziomy miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym i inne istotne parametry. Różnice między dwiema grupami zostaną przeanalizowane przy użyciu odpowiednio testu t-Studenta, testu Manna-Whitneya, dokładnego testu Fishera lub testu log-rank; wielokrotne porównania zostaną przeprowadzone za pomocą ANOVA, a następnie Tukey HSD lub Kruskala-Wallisa. Zostaną wykonane współczynniki korelacji Pearsona lub nieparametrycznego Spearmana w celu oceny związku poziomów miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym lub specyficznych wariantach genetycznych MIR142 i SLC1A3 (lub odpowiedniego składnika PCA, patrz dalej) z ciągłymi parametrami demograficznymi, klinicznymi i neuroradiologicznymi ( np. wiek, zmiany w EDSS, liczba zmian T2, itp.). Dla porównań wielokrotnych kontrolowany będzie współczynnik fałszywego wykrywania (FDR) metodą zaproponowaną przez Benjaminiego i Hochberga.

PCA zostanie zastosowane do reprezentowania zestawów potencjalnie skorelowanych zmiennych (poziomy miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym lub specyficzne warianty genetyczne MIR142 i SLC1A3, zapalne i potencjalnie ekscytotoksyczne czynniki białkowe oraz poziomy neurofilamentów, beta amyloidu, białka tau i czynników wzrostu) z główne składowe (PC), które są liniowo nieskorelowane, uzyskane za pomocą transformacji ortogonalnej. Komputery są uporządkowane tak, aby pierwszy komputer miał największą możliwą wariancję i wybrano tylko niektóre składniki reprezentujące skorelowane zmienne. W rezultacie zmniejsza się wymiar zmiennych.

Aby zweryfikować miR-142-3p jako biomarker progresji choroby wywołanej synaptopatią (mierzonej pod względem zmian klinicznych lub radiologicznych i zmiennych TMS) lub specyficznych SNP MIR142 i SLC1A3 powiązanych z synaptopatią SM, zostaną zastosowane modele GLM, biorąc pod uwagę, odpowiednio, poziom miR-142-3p w płynie mózgowo-rdzeniowym (lub zidentyfikowanych składnikach PCA, w tym miR) lub wariantach genetycznych jako zmienną niezależną dostosowującą się do czynników demograficznych, klinicznych, neuroradiologicznych, neurofizjologicznych, biochemicznych i leczenia.

Dane zostaną przedstawione jako średnia (odchylenie standardowe, sd) lub mediana (25-75 percentyl). Poziom istotności ustalono na p<0,05.