miR-142-3p som potensiell biomarkør for synaptopati i MS

I det siste tiåret har strukturelle og funksjonelle synaptiske endringer, samlet kjent som synaptopati, kommet opp som en determinant patologisk prosess som bidrar til den nevrodegenerative skaden i multippel sklerose (MS) og dens musemodell, den eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt (EAE). Siden synaptisk endring og tap er reversible, i motsetning til tap av nevroner, kan en tidlig påvisning tillate en tidlig klinisk intervensjon med potensielt bedre terapeutiske resultater, men pålitelige biomarkører er ikke tilgjengelige ennå.

MikroRNA (miRs) som sirkulerer i cerebrospinalvæskene (CSF) er gode kandidater som mulige sensitive biomarkører for MS-synaptopati-drevet sykdomsprogresjon. De representerer en ny klasse av modulatorer av genuttrykk med stabil tilstedeværelse i kroppsvæskene og med en kritisk rolle i mange fysiologiske og patologiske prosesser, spesielt i sentralnervesystemet. Følgelig har det nylig blitt demonstrert at miR-142-3p er en avgjørende komponent i en skadelig regulatorisk akse for EAE/MS eksitotoksiske synaptiske dysfunksjoner, ved å redusere nivået av glial glutamat aspartat transporter/eksitatorisk aminosyre transporter 1 (GLAST/EAAT1) ) protein. Videre er miR-142-3p-nivåer økt i både EAE-hjerner og CSF-er hos pasienter med relapsing-remitting MS (RRMS) og korrelerer med sykdomsprogresjon. Foreløpige data avslører også at miR-142-3p er direkte mål for forskjellige farmakologiske behandlinger for MS, mens virkningen av ikke-farmakologiske behandlinger, som terapeutisk transkraniell magnetisk stimulering (TMS) for å forbedre MS spastisitet, fortsatt er ukjent.

Basert på disse betraktningene, vil en prospektiv og retrospektiv kohortstudie på rundt seks år bli utført for å vurdere om miR-142-3p er en mulig biomarkør for MS synaptopati-drevet sykdomsprogresjon (AIM1) og for effekten av sykdomsmodifiserende behandlinger ( DMT) som brukes i MS-terapi (AIM2a). Videre vil en genetisk screening fra perifert blod bli utført for å identifisere enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP-er) i kodende og/eller regulerende regioner av miR-142-3p og GLAST/EAAT1-gener, assosiert med MS-synaptopati (AIM2b). Til slutt vil en repeterende TMS-stimuleringsprotokoll (iTBS) bli utført i en undergruppe av screenede MS-pasienter med spastisitet i underekstremiteter (intervensjonell substudie) for å evaluere pasientens respons på behandlingen knyttet til de identifiserte SNP-ene (AIM2c).

Gitt heterogeniteten og kompleksiteten til MS-sykdom, vil multivariabel tilnærming tillate å dissekere miR-142-3p-bidrag til MS-forløp påvirket av synaptopati (AIM1).

For det første vil miR-142-3p-nivåer i MS CSF (dagen for rekruttering, T0) være korrelert med andre mulige variabler som er relevante for sykdomsprogresjon, for eksempel:

• klinisk (sykdomsvarighet, estimert som antall år fra debut til siste vurdering av funksjonshemming; funksjonshemming, evaluert ved hjelp av EDSS = Expanded Disability Status Scale; Progresjonsindeks, PI = EDSS/sykdomsvarighet; endring i ARR = Annualized Relapse Rate) og nevroradiologiske parametere (dobbel-ekko-protontetthet; FLAIR = væskedempet inversjonsgjenoppretting; T2-WI = T2-veide spin-ekko-bilder og T1-WI = pre-kontrast og post-kontrast T1-veide spin-ekko bilder etter intravenøs gadolinium (Gd) infusjon) ved T0 og en gang per år i løpet av en 6-års oppfølging hvis det ikke oppstår tilbakefall (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• nivåer av inflammatoriske og potensielle eksitotoksiske proteinfaktorer (som IL-1β, TNF og RANTES-CCL5) i CSF (T0);
• nivåer av neurofilamenter, beta-amyloid, tau-proteiner og vekstfaktorer (som NGF, PDGF og BDNF) i CSF, som mulige indikatorer på nevrodegenerative og regenerative prosesser som oppstår ved CSF-uttak (T0).

For å redusere den variable dimensjonen, vil Principal Component Analysis (PCA) brukes under hensyntagen til bidraget fra miR-142-3p til sykdomsprogresjon som en del av et komplekst nettverk av molekyler som sirkulerer i CSF, og univariable og multivariable korrelasjoner vil bli gjentatt .

I multivariabel analyse (basert på multivariable generaliserte lineære modeller, GLM), vil miR-142-3p-nivåer i CSF (eller PCA-komponenter inkludert miR-142-3p som en del av komponenten) betraktes som den uavhengige variabelen som justerer for demografiske, kliniske og neuroradiologiske verdier samt ulike DMT-behandlinger. En videre analyse basert på behandlingsstratifikasjoner av pasientene vil bli forsøkt (AIM2a).

Til slutt vil CSF-nivåene av miR-142-3p (eller PCA-komponenter inkludert miR-142-3p) identifisert for å assosieres med sykdomsprogresjonsvariabler være korrelert med nevrofysiologiske parametere, registrert ved hjelp av TMS for å evaluere kortikal eksitabilitet og plastisitet (SICI = kort intervall intrakortikal inhibering; ICF = intrakortikal tilrettelegging; LICI = lang intervall intrakortikal hemming; PAS = Paired Associative Stimulation) hos MS-pasienter ved T0. Dermed vil miR-142-3p som sirkulerer i CSF bli validert som mulige biomarkører for synaptopati-drevet sykdomsprogresjon (som enkeltmolekyler eller som en del av en PCA-komponent).

For å identifisere genetiske varianter av miR-142-3p og GLAST/EAAT1-kodende gener som er relevante for MS-synaptopati (AIM2b) vil SNP-er bli analysert ved T0 og vil bli korrelert med miR-142-3p-nivåer i CSF og med andre mulige variabler som er relevante for sykdomsprogresjon som i AIM1. PCA- og GLM-modeller vil bli brukt som i AIM1.

For å evaluere behandlingsrespons i undergruppen av screenede MS-pasienter inkludert i den intervensjonelle substudien basert på en to-ukers protokoll av iTBS for å redusere spastisitet i underekstremiteter, H/M-amplitudeforholdet til Soleus H-refleksen og Modified Ashworth Scale (MAS) vil bli vurdert før (W0) og etter (W2) stimuleringsprotokollen. Mulig assosiasjon mellom pasientens respons på iTBS-stimuleringsprotokollen og spesifikke SNP-er vil bli vurdert (AIM2c).

Statistisk analyse vil bli utført ved å bruke Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, R-programvare og T-MEV 4.4.1. Data vil bli testet for normalitetsfordeling gjennom Kolmogorov-Smirnov- og Shapiro-Wilk-testene. k-means-metoden vil bli brukt til å dele MS-pasienter inn i homogene klynger, basert på miR-142-3p-nivåer i CSF og andre relevante parametere. Forskjeller mellom to grupper vil bli analysert ved å bruke Students t-test, Mann-Whitney test, Fisher eksakt test eller log-rank test, etter behov; flere sammenligninger vil bli utført av ANOVA etterfulgt av Tukey HSD eller av Kruskal-Wallis. Pearson eller ikke-parametriske Spearman-korrelasjonskoeffisienter vil bli utført for å evaluere assosiasjonen av miR-142-3p-nivåer i CSF eller spesifikke genetiske varianter av MIR142 og SLC1A3 (eller den korresponderende PCA-komponenten, se neste) med kontinuerlige demografiske, kliniske og nevroradiologiske parametere ( f.eks. alder, endringer i EDSS, antall T2-lesjoner, etc.). For de flere sammenligningene vil det bli kontrollert False Discovery Rate (FDR) ved å bruke metoden foreslått av Benjamini og Hochberg.

PCA vil bli brukt for å representere sett med potensielt korrelerte variabler (CSF-nivåer av miR-142-3p eller spesifikke genetiske varianter av MIR142 og SLC1A3, inflammatoriske og potensielle eksitotoksiske proteinfaktorer og nivåer av neurofilamenter, beta-amyloid, tau-protein og vekstfaktorer) med hovedkomponenter (PC) som er lineært ukorrelerte oppnådd ved bruk av ortogonal transformasjon. PC-er er ordnet slik at den første PC-en har størst mulig varians og kun noen komponenter er valgt for å representere de korrelerte variablene. Som et resultat reduseres dimensjonen til variablene.

For å validere miR-142-3p som biomarkør for synaptopati-drevet sykdomsprogresjon (målt i form av kliniske eller radiologiske endringer og TMS-variabler) eller spesifikke SNP-er av MIR142 og SLC1A3 knyttet til MS-synaptopati, vil GLM-modeller bli brukt med tanke på hhv. miR-142-3p-nivået i CSF (eller de identifiserte PCA-komponentene inkludert miRs) eller de genetiske variantene som en uavhengig variabel som justerer for demografiske, kliniske, nevroradiologiske, nevrofysiologiske, biokjemiske faktorer og behandlinger.

Data vil bli presentert som gjennomsnitt (standardavvik, sd) eller median (25.-75. persentil). Signifikansnivået er fastsatt til p<0,05.