miR-142-3p como potencial biomarcador de sinaptopatia na EM

Na última década, alterações sinápticas estruturais e funcionais, conhecidas coletivamente como sinaptopatia, surgiram como um processo patológico determinante para o dano neurodegenerativo na esclerose múltipla (EM) e seu modelo camundongo, a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Como a alteração e perda sináptica são reversíveis, ao contrário da perda de neurônios, uma detecção precoce pode permitir uma intervenção clínica precoce com resultados terapêuticos potencialmente melhores, mas biomarcadores confiáveis ​​ainda não estão disponíveis.

Os microRNAs (miRs) que circulam no líquido cefalorraquidiano (LCR) são bons candidatos como possíveis biomarcadores sensíveis para a progressão da doença causada pela sinaptopatia da EM. Eles representam uma nova classe de moduladores da expressão gênica com presença estável nos fluidos corporais e com papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, especialmente no sistema nervoso central. Consequentemente, foi recentemente demonstrado que o miR-142-3p é um componente crucial em um eixo regulador prejudicial das disfunções sinápticas excitotóxicas de EAE/MS, reduzindo o nível do transportador glial de glutamato aspartato/transportador de aminoácidos excitatórios 1 (GLAST/EAAT1 ) proteína. Além disso, os níveis de miR-142-3p são aumentados em cérebros de EAE e CSFs de pacientes com EM remitente-recorrente (EMRR) e se correlacionam com a progressão da doença. Dados preliminares também revelam que o miR-142-3p é alvo direto de diferentes tratamentos farmacológicos para EM, enquanto a ação de tratamentos não farmacológicos, como a estimulação magnética transcraniana terapêutica (EMT) para melhorar a espasticidade da EM, ainda é desconhecida.

Com base nessas considerações, um estudo de coorte prospectivo e retrospectivo de cerca de seis anos será realizado para avaliar se o miR-142-3p é um possível biomarcador para a progressão da doença impulsionada pela sinaptopatia da EM (AIM1) e para a eficácia dos tratamentos modificadores da doença ( DMTs) atualmente usados ​​na terapia de MS (AIM2a). Além disso, uma triagem genética de sangue periférico será realizada para identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em regiões codificadoras e/ou reguladoras dos genes miR-142-3p e GLAST/EAAT1, associados à sinaptopatia da EM (AIM2b). Finalmente, um protocolo de estimulação EMT repetitiva (iTBS) será realizado em um subgrupo de pacientes com EM triados com espasticidade de membros inferiores (subestudo intervencional) para avaliar a capacidade de resposta do paciente ao tratamento vinculado aos SNPs identificados (AIM2c).

Dada a heterogeneidade e complexidade da doença de EM, a abordagem multivariada permitirá dissecar a contribuição do miR-142-3p para o curso da EM influenciado pela sinaptopatia (AIM1).

Em primeiro lugar, os níveis de miR-142-3p no MS CSF (o dia do recrutamento, T0) serão correlacionados com outras possíveis variáveis ​​relevantes para a progressão da doença, tais como:

• clínica (duração da doença, estimada como o número de anos desde o início até a avaliação mais recente de incapacidade; incapacidade, avaliada usando EDSS = Escala Expandida de Status de Incapacidade; Índice de Progressão, PI = EDSS/duração da doença; alteração em ARR = Taxa de Recaída Anualizada) e parâmetros neurorradiológicos (densidade de prótons dual-eco; FLAIR = recuperação de inversão atenuada por fluido; T2-WI = imagens spin-eco ponderadas em T2 e T1-WI = imagens spin-eco ponderadas em T1 pré-contraste e pós-contraste após administração intravenosa infusão de gadolínio (Gd) em T0 e uma vez por ano durante um acompanhamento de 6 anos se não ocorrer recidiva (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• níveis de fatores protéicos inflamatórios e potencialmente excitotóxicos (como IL-1β, TNF e RANTES-CCL5) no LCR (T0);
• níveis de neurofilamentos, beta-amilóide, proteínas tau e fatores de crescimento (como NGF, PDGF e BDNF) no LCR, como possíveis indicadores de processos neurodegenerativos e regenerativos ocorridos na retirada do LCR (T0).

Para reduzir a dimensão variável, a Análise de Componentes Principais (PCA) será aplicada levando em consideração a contribuição do miR-142-3p para a progressão da doença como parte de uma rede complexa de moléculas circulando no LCR, e correlações univariadas e multivariadas serão repetidas .

Na análise multivariável (com base em modelos lineares generalizados multivariáveis, GLM), os níveis de miR-142-3p no LCR (ou componentes PCA incluindo miR-142-3p como parte do componente) serão considerados como o ajuste variável independente para dados demográficos, valores clínicos e neurorradiológicos, bem como diferentes tratamentos DMT. Uma análise adicional baseada em estratificações de tratamento dos pacientes será tentada (AIM2a).

Por fim, os níveis de miR-142-3p no LCR (ou componentes de PCA incluindo miR-142-3p) identificados como associados a variáveis ​​de progressão da doença serão correlacionados com parâmetros neurofisiológicos, registrados por meio de TMS para avaliar a excitabilidade e plasticidade cortical (SICI = inibição intracortical de intervalo curto; ICF = facilitação intracortical; LICI = inibição intracortical de intervalo longo; PAS = Estimulação Associativa Pareada) em pacientes com EM em T0. Assim, o miR-142-3p circulando no LCR será validado como possível biomarcador da progressão da doença induzida por sinaptopatia (como moléculas únicas ou como parte de um componente PCA).

Para identificar variantes genéticas dos genes que codificam miR-142-3p e GLAST/EAAT1 relevantes para a sinaptopatia da EM (AIM2b), os SNPs serão analisados ​​em T0 e serão correlacionados com os níveis de miR-142-3p no LCR e com outras possíveis variáveis ​​relevantes para progressão da doença como no AIM1. Os modelos PCA e GLM serão aplicados como no AIM1.

Avaliar a capacidade de resposta ao tratamento no subgrupo de pacientes com EM rastreados incluídos no subestudo intervencional com base em um protocolo de duas semanas de iTBS para reduzir a espasticidade dos membros inferiores, a relação de amplitude H/M do reflexo H do sóleo e a Escala de Ashworth Modificada (MAS). serão considerados antes (S0) e após (S2) o protocolo de estimulação. A possível associação entre a capacidade de resposta do paciente ao protocolo de estimulação iTBS e SNPs específicos será avaliada (AIM2c).

A análise estatística será realizada utilizando Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, software R e T-MEV 4.4.1. Os dados serão testados quanto à distribuição de normalidade por meio dos testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. O método k-means será usado para dividir os pacientes com EM em grupos homogêneos, com base nos níveis de miR-142-3p no LCR e outros parâmetros relevantes. As diferenças entre os dois grupos serão analisadas por meio do teste t de Student, teste de Mann-Whitney, teste exato de Fisher ou teste de log-rank, conforme apropriado; comparações múltiplas serão realizadas por ANOVA seguida por Tukey HSD ou por Kruskal-Wallis. Coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman não paramétricos serão realizados para avaliar a associação dos níveis de miR-142-3p no LCR ou variantes genéticas específicas de MIR142 e SLC1A3 (ou o componente PCA correspondente, veja a seguir) com parâmetros demográficos, clínicos e neurorradiológicos contínuos ( por exemplo, idade, alterações no EDSS, número de lesões T2, etc.). Para as comparações múltiplas será controlado o False Discovery Rate (FDR) aplicando o método proposto por Benjamini e Hochberg.

O PCA será aplicado para representar conjuntos de variáveis ​​potencialmente correlacionadas (níveis de miR-142-3p no LCR ou variantes genéticas específicas de MIR142 e SLC1A3, fatores inflamatórios e potenciais proteínas excitotóxicas e níveis de neurofilamentos, beta-amilóide, proteína tau e fatores de crescimento) com componentes principais (PC) linearmente não correlacionados obtidos por transformação ortogonal. Os PCs são ordenados de modo que o primeiro PC tenha a maior variância possível e apenas alguns componentes são selecionados para representar as variáveis ​​correlacionadas. Como resultado, a dimensão das variáveis ​​é reduzida.

Para validar o miR-142-3p como biomarcador de progressão da doença induzida por sinaptopatia (medida em termos de alterações clínicas ou radiológicas e variáveis ​​TMS) ou SNPs específicos de MIR142 e SLC1A3 ligados à sinaptopatia MS, modelos GLM serão aplicados considerando, respectivamente, o nível de miR-142-3p no LCR (ou os componentes PCA identificados, incluindo miRs) ou as variantes genéticas como uma variável independente de ajuste para fatores demográficos, clínicos, neurorradiológicos, neurofisiológicos, bioquímicos e tratamentos.

Os dados serão apresentados como média (desvio padrão, dp) ou mediana (25º-75º percentil). O nível de significância é estabelecido em p<0,05.