miR-142-3p som potentiell biomarkör för synaptopati i MS

Under det senaste decenniet har strukturella och funktionella synaptiska förändringar, gemensamt känd som synaptopati, kommit upp som en avgörande patologisk process som bidrar till den neurodegenerativa skadan vid multipel skleros (MS) och dess musmodell, den experimentella autoimmuna encefalomyeliten (EAE). Eftersom synaptisk förändring och förlust är reversibla, till skillnad från förlust av neuroner, kan en tidig upptäckt tillåta en förtidig klinisk intervention med potentiellt bättre terapeutiska resultat men tillförlitliga biomarkörer är inte tillgängliga ännu.

MikroRNA (miRs) som cirkulerar i cerebrospinalvätskorna (CSF) är goda kandidater som möjliga känsliga biomarkörer för MS-synaptopati-driven sjukdomsprogression. De representerar en ny klass av modulatorer av genuttryck med stabil närvaro i kroppsvätskorna och med en avgörande roll i många fysiologiska och patologiska processer, särskilt i det centrala nervsystemet. Följaktligen har det nyligen visats att miR-142-3p är en avgörande komponent i en skadlig regulatorisk axel för EAE/MS excitotoxiska synaptiska dysfunktioner, genom att minska nivån av glial glutamat aspartattransportör/excitatorisk aminosyratransportör 1 (GLAST/EAAT1) ) protein. Dessutom är miR-142-3p-nivåer ökade i både EAE-hjärnor och CSF hos patienter med skov-remitterande MS (RRMS) och korrelerar med sjukdomsprogression. Preliminära data avslöjar också att miR-142-3p är direkt mål för olika farmakologiska behandlingar för MS, medan effekten av icke-farmakologiska behandlingar, som terapeutisk transkraniell magnetisk stimulering (TMS) för att förbättra MS spasticitet, fortfarande är okänd.

Baserat på dessa överväganden kommer en prospektiv och retrospektiv kohortstudie på cirka sex år att utföras för att bedöma om miR-142-3p är en möjlig biomarkör för MS synaptopati-driven sjukdomsprogression (AIM1) och för effektiviteten av sjukdomsmodifierande behandlingar ( DMT) som för närvarande används i MS-terapi (AIM2a). Dessutom kommer en genetisk screening från perifert blod att utföras för att identifiera singelnukleotidpolymorfismer (SNP) i kodande och/eller reglerande regioner av miR-142-3p och GLAST/EAAT1-gener, associerade med MS-synaptopati (AIM2b). Slutligen kommer ett repetitivt TMS-stimuleringsprotokoll (iTBS) att utföras i en undergrupp av screenade MS-patienter med spasticitet i nedre extremiteterna (interventionell substudie) för att utvärdera patientens lyhördhet för behandlingen kopplad till de identifierade SNP:erna (AIM2c).

Med tanke på heterogeniteten och komplexiteten av MS-sjukdom, kommer multivariabel metod att tillåta att dissekera miR-142-3p bidrag till MS-förloppet påverkat av synaptopati (AIM1).

För det första kommer nivåerna av miR-142-3p i MS CSF (rekryteringsdagen, T0) att korreleras med andra möjliga variabler som är relevanta för sjukdomsprogression, såsom:

• klinisk (sjukdomslängd, uppskattad som antalet år från debut till den senaste bedömningen av funktionshinder; funktionshinder, utvärderad med EDSS = Expanded Disability Status Scale; Progressionsindex, PI = EDSS/sjukdomsduration; förändring i ARR = Annualized Relapse Rate) och neuroradiologiska parametrar (dubbeleko-protondensitet; FLAIR = vätskeförsvagad inversionsåtervinning; T2-WI = T2-viktade spin-eko-bilder och T1-WI = pre-kontrast och post-kontrast T1-vägda spin-eko-bilder efter intravenös gadolinium (Gd) infusion) vid T0 och en gång per år under en 6-års uppföljning om inget återfall inträffar (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• nivåer av inflammatoriska och potentiella excitotoxiska proteinfaktorer (som IL-1β, TNF och RANTES-CCL5) i CSF (TO);
• nivåer av neurofilament, beta-amyloid, tau-proteiner och tillväxtfaktorer (som NGF, PDGF och BDNF) i CSF, som möjliga indikatorer på neurodegenerativa och regenerativa processer som inträffar vid CSF-abstinensen (T0).

För att minska den variabla dimensionen kommer Principal Component Analysis (PCA) att tillämpas med hänsyn till bidraget från miR-142-3p till sjukdomsprogression som en del av ett komplext nätverk av molekyler som cirkulerar i CSF, och univariabla och multivariabla korrelationer kommer att upprepas .

I multivariabel analys (baserad på multivariabla generaliserade linjära modeller, GLM), kommer miR-142-3p-nivåer i CSF (eller PCA-komponenter inklusive miR-142-3p som en del av komponenten) att betraktas som den oberoende variabeln som justerar för demografiska, kliniska och neuroradiologiska värden samt olika DMT-behandlingar. En ytterligare analys baserad på behandlingsstratifieringar av patienterna kommer att göras (AIM2a).

Slutligen kommer CSF-nivåerna av miR-142-3p (eller PCA-komponenter inklusive miR-142-3p) som identifieras för att associera med sjukdomsprogressionsvariabler att korreleras med neurofysiologiska parametrar, registrerade med hjälp av TMS för att utvärdera kortikal excitabilitet och plasticitet (SICI = kort intervall intrakortikal hämning, ICF = intrakortikal facilitering, LICI = lång intervall intrakortikal hämning, PAS = Paired Associative Stimulation) hos MS-patienter vid T0. Således kommer miR-142-3p som cirkulerar i CSF att valideras som möjliga biomarkörer för synaptopati-driven sjukdomsprogression (som enstaka molekyler eller som en del av en PCA-komponent).

För att identifiera genetiska varianter av miR-142-3p och GLAST/EAAT1-kodande gener relevanta för MS-synaptopati (AIM2b) kommer SNP:er att analyseras vid T0 och kommer att korreleras med miR-142-3p-nivåer i CSF och med andra möjliga variabler som är relevanta för sjukdomsprogression som i AIM1. PCA- och GLM-modeller kommer att tillämpas som i AIM1.

För att utvärdera behandlingssvar i undergruppen av screenade MS-patienter som ingår i den interventionella substudien baserat på ett tvåveckorsprotokoll av iTBS för att minska spasticitet i nedre extremiteter, H/M-amplitudförhållandet för Soleus H-reflexen och Modified Ashworth-skalan (MAS) kommer att övervägas före (W0) och efter (W2) stimuleringsprotokollet. Möjligt samband mellan patientens lyhördhet för iTBS-stimuleringsprotokollet och specifika SNP:er kommer att bedömas (AIM2c).

Statistisk analys kommer att utföras med Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, R-programvara och T-MEV 4.4.1. Data kommer att testas för normalitetsfördelning genom Kolmogorov-Smirnov- och Shapiro-Wilk-testerna. Metoden k-means kommer att användas för att dela upp MS-patienter i homogena kluster, baserat på miR-142-3p-nivåer i CSF och andra relevanta parametrar. Skillnader mellan två grupper kommer att analyseras med hjälp av Students t-test, Mann-Whitney-test, Fisher exakta test eller log-rank test, beroende på vad som är lämpligt; flera jämförelser kommer att utföras av ANOVA följt av Tukey HSD eller av Kruskal-Wallis. Pearson eller icke-parametriska Spearman-korrelationskoefficienter kommer att utföras för att utvärdera sambandet mellan miR-142-3p-nivåer i CSF eller specifika genetiska varianter av MIR142 och SLC1A3 (eller motsvarande PCA-komponent, se nästa) med kontinuerliga demografiska, kliniska och neuroradiologiska parametrar ( t.ex. ålder, förändringar i EDSS, antal T2 lesioner, etc.). För de multipla jämförelserna kommer det att kontrolleras False Discovery Rate (FDR) med tillämpning av den metod som föreslagits av Benjamini och Hochberg.

PCA kommer att användas för att representera uppsättningar av potentiellt korrelerade variabler (CSF-nivåer av miR-142-3p eller specifika genetiska varianter av MIR142 och SLC1A3, inflammatoriska och potentiella excitotoxiska proteinfaktorer och nivåer av neurofilament, beta-amyloid, tau-protein och tillväxtfaktorer) med huvudkomponenter (PC) som är linjärt okorrelerade erhållna med ortogonal transformation. PC:er är ordnade så att den första PC:n har största möjliga varians och endast några komponenter väljs för att representera de korrelerade variablerna. Som ett resultat minskar dimensionen av variablerna.

För att validera miR-142-3p som biomarkör för synaptopati-driven sjukdomsprogression (mätt i termer av kliniska eller radiologiska förändringar och TMS-variabler) eller specifika SNP:er av MIR142 och SLC1A3 kopplade till MS-synaptopati, kommer GLM-modeller att tillämpas med hänsyn till respektive miR-142-3p-nivån i CSF (eller de identifierade PCA-komponenterna inklusive miRs) eller de genetiska varianterna som en oberoende variabel som justerar för demografiska, kliniska, neuroradiologiska, neurofysiologiska, biokemiska faktorer och behandlingar.

Data kommer att presenteras som medelvärde (standardavvikelse, sd) eller median (25:e-75:e percentilen). Signifikansnivån fastställs till p<0,05.