miR-142-3p como posible biomarcador de sinaptopatía en la EM

En la última década, las alteraciones sinápticas estructurales y funcionales, conocidas colectivamente como sinaptopatía, han surgido como un proceso patológico determinante que contribuye al daño neurodegenerativo en la esclerosis múltiple (EM) y su modelo murino, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Dado que la alteración y la pérdida sináptica son reversibles, a diferencia de la pérdida de neuronas, una detección temprana podría permitir una intervención clínica precoz con resultados terapéuticos potencialmente mejores, pero aún no se dispone de biomarcadores fiables.

Los microARN (miR) que circulan en el líquido cefalorraquídeo (LCR) son buenos candidatos como posibles biomarcadores sensibles para la progresión de la enfermedad impulsada por la sinaptopatía de la EM. Representan una nueva clase de moduladores de la expresión génica con presencia estable en los fluidos corporales y con un papel crítico en muchos procesos fisiológicos y patológicos, especialmente en el sistema nervioso central. En consecuencia, se ha demostrado recientemente que miR-142-3p es un componente crucial en un eje regulador perjudicial de las disfunciones sinápticas excitotóxicas de EAE/MS, al reducir el nivel del transportador de glutamato aspartato glial/transportador de aminoácidos excitatorios 1 (GLAST/EAAT1 ) proteína. Además, los niveles de miR-142-3p aumentan tanto en los cerebros con EAE como en los LCR de pacientes con EM remitente-recurrente (EMRR) y se correlacionan con la progresión de la enfermedad. Los datos preliminares también revelan que miR-142-3p es el objetivo directo de diferentes tratamientos farmacológicos para la EM, mientras que aún se desconoce la acción de los tratamientos no farmacológicos, como la estimulación magnética transcraneal (TMS) terapéutica para mejorar la espasticidad de la EM.

Sobre la base de estas consideraciones, se realizará un estudio de cohortes prospectivo y retrospectivo de aproximadamente seis años para evaluar si miR-142-3p es un posible biomarcador para la progresión de la enfermedad impulsada por la sinaptopatía de la EM (AIM1) y para la eficacia de los tratamientos modificadores de la enfermedad ( DMT) utilizados actualmente en la terapia de la EM (AIM2a). Además, se realizará un cribado genético en sangre periférica para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en regiones codificantes y/o reguladoras de los genes miR-142-3p y GLAST/EAAT1, asociados a la sinaptopatía de la EM (AIM2b). Finalmente, se realizará un protocolo de estimulación TMS repetitiva (iTBS) en un subgrupo de pacientes con EM seleccionados con espasticidad en las extremidades inferiores (subestudio intervencionista) para evaluar la respuesta del paciente al tratamiento relacionado con los SNP identificados (AIM2c).

Dada la heterogeneidad y complejidad de la enfermedad de la EM, el enfoque multivariable permitirá diseccionar la contribución de miR-142-3p al curso de la EM influenciado por la sinaptopatía (AIM1).

En primer lugar, los niveles de miR-142-3p en el LCR de la EM (el día del reclutamiento, T0) se correlacionarán con otras posibles variables relevantes para la progresión de la enfermedad, como:

• clínico (duración de la enfermedad, estimada como el número de años desde el inicio hasta la evaluación más reciente de la discapacidad; discapacidad, evaluada usando EDSS = Escala de Estado de Discapacidad Ampliada; Índice de Progresión, PI = EDSS/duración de la enfermedad; cambio en ARR = Tasa de Recaída Anualizada) y parámetros neurorradiológicos (densidad de protones de doble eco; FLAIR = recuperación de inversión atenuada por líquido; T2-WI = imágenes de eco de espín ponderadas en T2 y T1-WI = imágenes de eco de espín ponderadas en T1 antes y después del contraste después infusión de gadolinio (Gd)) en T0 y una vez al año durante un seguimiento de 6 años si no ocurre una recaída (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• niveles de factores proteicos inflamatorios y potencialmente excitotóxicos (como IL-1β, TNF y RANTES-CCL5) en el LCR (T0);
• niveles de neurofilamentos, beta amiloide, proteínas tau y factores de crecimiento (como NGF, PDGF y BDNF) en el LCR, como posibles indicadores de procesos neurodegenerativos y regenerativos que ocurren en la extracción del LCR (T0).

Para reducir la dimensión variable, se aplicará el Análisis de Componentes Principales (PCA) teniendo en cuenta la contribución de miR-142-3p a la progresión de la enfermedad como parte de una red compleja de moléculas que circulan en el LCR, y se repetirán correlaciones univariables y multivariables .

En el análisis multivariable (basado en modelos lineales generalizados multivariables, GLM), los niveles de miR-142-3p en el LCR (o componentes PCA que incluyen miR-142-3p como parte del componente) se considerarán como la variable independiente que se ajusta por demografía, valores clínicos y neurorradiológicos así como diferentes tratamientos con DMT. Se intentará un análisis adicional basado en estratificaciones de tratamiento de los pacientes (AIM2a).

Por último, los niveles en LCR de miR-142-3p (o componentes PCA incluyendo miR-142-3p) identificados para asociarse con variables de progresión de la enfermedad se correlacionarán con parámetros neurofisiológicos, registrados por medio de TMS para evaluar la excitabilidad y plasticidad cortical (SICI = inhibición intracortical de intervalo corto; ICF = facilitación intracortical; LICI = inhibición intracortical de intervalo largo; PAS = estimulación asociativa emparejada) en pacientes con EM en T0. Por lo tanto, el miR-142-3p que circula en el LCR se validará como posible biomarcador de la progresión de la enfermedad impulsada por la sinaptopatía (como moléculas individuales o como parte de un componente PCA).

Para identificar variantes genéticas de miR-142-3p y genes codificantes de GLAST/EAAT1 relevantes para la sinaptopatía de la EM (AIM2b), los SNP se analizarán en T0 y se correlacionarán con los niveles de miR-142-3p en el LCR y con otras posibles variables relevantes para progresión de la enfermedad como en AIM1. Los modelos PCA y GLM se aplicarán como en AIM1.

Evaluar la capacidad de respuesta al tratamiento en el subgrupo de pacientes con EM seleccionados incluidos en el subestudio de intervención basado en un protocolo de dos semanas de iTBS para reducir la espasticidad de las extremidades inferiores, la relación de amplitud H/M del reflejo H del sóleo y la escala de Ashworth modificada (MAS) se considerará antes (W0) y después (W2) del protocolo de estimulación. Se evaluará la posible asociación entre la capacidad de respuesta del paciente al protocolo de estimulación iTBS y SNP específicos (AIM2c).

El análisis estadístico se realizará utilizando Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, software R y T-MEV 4.4.1. Se probará la distribución de normalidad de los datos a través de las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk. El método k-means se utilizará para dividir a los pacientes con EM en grupos homogéneos, según los niveles de miR-142-3p en el LCR y otros parámetros relevantes. Las diferencias entre dos grupos se analizarán utilizando la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, la prueba exacta de Fisher o la prueba de rango logarítmico, según corresponda; se realizarán comparaciones múltiples mediante ANOVA seguido de Tukey HSD o Kruskal-Wallis. Se realizarán coeficientes de correlación de Pearson o Spearman no paramétricos para evaluar la asociación de los niveles de miR-142-3p en el LCR o variantes genéticas específicas de MIR142 y SLC1A3 (o el componente PCA correspondiente, ver a continuación) con parámetros demográficos, clínicos y neurorradiológicos continuos ( ej., edad, cambios en EDSS, número de lesiones T2, etc.). Para las comparaciones múltiples se controlará la Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) aplicando el método propuesto por Benjamini y Hochberg.

Se aplicará PCA para representar conjuntos de variables potencialmente correlacionadas (niveles en LCR de miR-142-3p o variantes genéticas específicas de MIR142 y SLC1A3, factores proteicos inflamatorios y excitotóxicos potenciales y niveles de neurofilamentos, beta amiloide, proteína tau y factores de crecimiento) con componentes principales (PC) que no están correlacionados linealmente obtenidos mediante transformación ortogonal. Las PC se ordenan de modo que la primera PC tenga la mayor varianza posible y solo se seleccionan algunos componentes para representar las variables correlacionadas. Como resultado, la dimensión de las variables se reduce.

Para validar miR-142-3p como biomarcador de la progresión de la enfermedad impulsada por la sinaptopatía (medida en términos de cambios clínicos o radiológicos y variables TMS) o SNP específicos de MIR142 y SLC1A3 vinculados a la sinaptopatía de la EM, se aplicarán modelos GLM considerando, respectivamente, la Nivel de miR-142-3p en el LCR (o los componentes PCA identificados, incluidos los miR) o las variantes genéticas como una variable independiente que se ajusta a los tratamientos y factores demográficos, clínicos, neurorradiológicos, neurofisiológicos y bioquímicos.

Los datos se presentarán como la media (desviación estándar, sd) o mediana (percentil 25-75). El nivel de significación se establece en p<0,05.