确定乌干达患有 COPD 的 HIV 感染者肺部的细菌群落。 (LMB)

背景

艾滋病病毒感染者/艾滋病患者 (PLWHA) 获得抗逆转录病毒疗法 (ART) 的情况有所改善，从而降低了与艾滋病毒相关的发病率和死亡率。 在艾滋病毒负担最重的低收入和中等收入国家 (LMIC) 尤其如此。 死亡率的降低大大延长了预期寿命，据估计，艾滋病病毒感染者的寿命现在已接近普通人群的寿命（Asiki、Reniers 等人，2016 年）。 因此，幸存者越来越关注新出现的非传染性疾病 (NCD) 负担，例如慢性阻塞性肺病 (COPD)（Geneau、Stuckler 等人，2010 年）。 撒哈拉以南非洲地区的 PLWHA 密度最高，其 COPD 相关发病率和死亡率急剧上升（van Zyl Smit、Pai 等人，2010 年；Asiki、Reniers 等人，2016 年）。 迫切需要开展研究以进一步阐明 COPD 的发病机制，并确定最佳筛查和治疗策略（Asiki、Reniers 等人 2016 年；Drummond、Kunisaki 等人 2016 年）。 肺生态失调与 COPD 恶化表型之间的关联已在普通人群中得到证实（Wang，Bafadhel 等人，2016 年）。 然而，与普通人群相比，为什么 PLWHA 的 COPD 患病率更高仍然未知（Drummond、Kunisaki 等人，2016 年）。 目前尚无关于包括乌干达在内的撒哈拉以南非洲一般人群肺部微生物组的数据。 有必要探索肺部微生物组的动态（Cui、Morris 等人，2014 年；Wang、Bafadhel 等人，2016 年），并阐明免疫介导的反应可能导致不可逆的肺损伤，这种损伤可能在 HIV 感染的情况下导致肺生态失调感染（Hutchinson、Vlahos 等人，2014 年；Wang、Bafadhel 等人，2016 年）。 了解肺生态失调在 HIV 相关 COPD 发病机制中的作用对于 HIV/AIDS 负担最高的非洲环境至关重要（Cassol、Cassetta 等人，2010 年；Morris、George 等人，2011 年）。

研究假设

HIV 感染者肺部微生物组的改变与慢性阻塞性肺病 (COPD) 相关。

具体目标

1. 确定未感染 HIV 和未感染 COPD 的个体（健康对照）的肺微生物组。
2. 确定感染 HIV 的慢性阻塞性肺病患者的肺微生物组。
3. 比较感染 HIV 的 COPD 患者和 HIV 阴性的 COPD 患者的肺微生物组。
4. 确定 HIV 感染者肺微生物组与 COPD 之间的关联。

问题陈述

尽管目前西方世界正在进行多项关于肺微生物组及其在 COPD 恶化中的作用的研究（Cui, Morris 等人 2014 年，Sze, Hogg 等人 2014 年，Wang, Bafadhel 等人 2016 年），但有限的关于 HIV 在 COPD 发病机制中的作用的文献（Morris, George 等人 2011 年，Drummond, Kunisaki 等人 2016 年）。 目前尚不清楚为什么 HIV 感染者患 COPD 的患病率高于 HIV 阴性者（Morris, George et al. 2011）。 目前尚无关于包括乌干达在内的撒哈拉以南非洲一般人群肺部微生物组的数据。 迫切需要开展研究来描述非慢性阻塞性肺病患者的肺部微生物组，并阐明 HIV 感染慢性阻塞性肺病的发病机制（Mor​​ris、George 等人 2011 年；Drummond、Kunisaki 等人 2016 年）。

理由

在 HIV/AIDs 负担最重的非洲环境中，建立肺微生物组与 HIV 相关 COPD 之间的关联具有极其重要的意义。此类研究的知识将指导 HIV 人群中 COPD 最佳筛查和治疗策略的制定。

方法

一项横断面研究将在参加 Nakaseke ART 诊所的 HIV 感染者和来自 Nakaseke 肺功能 (LiNK) 研究的 HIV 阴性个体中进行。

估计样本量

使用人类微生物组计划-R (HMP-R) 统计包（版本 1.4.3）对基于分类学的人类微生物组数据进行假设检验和功效计算，该统计包在 Dirichlet 多项式模型上运行[33]，对于显着性水平（alpha设为 = 5%), 参与者人数 N = 50;序列读取数≥20,000（考虑为质量控制截止），功效≥99.99%（该功效足以检测预期在序列数据中观察到的效应大小）。 考虑到 20% 的未参与率，每组的样本量将为 63 名参与者。

研究地点选择

Nakaseke 地区的 ART 诊所已被选为研究地点，因为正在进行的 COPD/HIV 研究的目的是确定 HIV 中与 COPD 相关的患病率和因素。 超过 752 名 HIV 感染者已按照标准指南接受了 COPD 筛查。 此外，LiNK 研究（Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley）也在 Nakaseke 进行。 这是一项基于人群的观察性研究，使用 1000 名 35 岁以上的全职 Nakaseke 居民的分层随机样本，评估 Nakaseke 农村社区的 COPD 患病率、危险因素和症状。

取样程序

使用 Epi 工具随机数生成器 (La Rosa, Brooks et al. 2012)，研究人员将从我们各自的队列中选择目标组中的 63 名参与者。 研究助理将记录他们的年龄、性别和吸烟史。 COPD+HIV+ 组将用于识别来自其​​他组的参与者。

学习计划

训练有素的研究助理和一名医务人员将驻扎在 Nakaseke ART 诊所。 将通过电话联系随机选择的参与者。 研究小组将向参与者解释方案，如果有兴趣，研究助理将安排一次研究访问。 他们将获得参与者的知情同意，并将进行基线肺活量测定。 研究人员将按照标准操作程序进行痰诱导程序。 将按照制造商的说明使用痰 DNA 收集、保存和分离试剂盒收集诱导痰标本。 防腐剂的成分可使采集的样本保存 2 年以上，而不会出现任何可检测到的 DNA 降解。

标本处理

标本将按照标准操作程序进行处理。 简而言之，将痰标本放入带有密封盖和吸水材料的防漏生物危害袋中。 所有标本的运输都将遵守当地和国家有关潜在传染性材料运输的法规。

标本处理核心实验室

位于麦克雷雷大学健康科学学院医学微生物学大楼三楼的分子诊断实验室和综合生物储存实验室将用于样本处理。

基因组DNA提取

使用市售试剂盒从 200 微升痰液样本中提取细菌基因组 DNA。

基因组 DNA 提取对照

在制备 DNA 样本时，ZymoBIOMICS 微生物群落标准将用作阳性样本对照。 来自 DNA 收集试剂盒的未添加样品的储存缓冲液将用作阴性对照。

V3 和 V4 高变区聚合酶链反应 (PCR) 扩增

16S rRNA 基因的 V3 和 V4 高变区将使用市售引物进行 PCR 扩增。

16S rRNA测序

DNA 测序将按照制造商的协议使用 MiSeq 测序平台分批进行。 每批将由来自两组的随机样本组成。 将执行 1x26 MiSeq 运行以检查样本的簇密度和标准化。 MiSeq Reporter 2.3 版的 Illumina 宏基因组学工作流程将用于多路分解索引读数、生成序列文件和分类读数。 将使用严格的标准来去除低质量和嵌合读数。

统计分析

对于特定目标 1、2 和 3

1. 聚类 16SrRNA 序列读入 OTU：

   在质量控制和数据清理之后，剩余的 reads 将接受开放参考操作分类单元 (OTU) 挑选（97% 身份截止），其中 reads 将首先根据 Greengenes 参考序列进行聚类。 OTUs将被稀疏到所有样本中reads的数量最少，稀疏的OTU表将用于评估alpha和beta多样性。 将执行折叠主坐标分析 (PCoA) 以评估结果的稳健性。

2. 与对照组相比，目标肺微生物组的组成：

研究人员将计算目标群体与对照组中所有已识别的分类集群 OTU 或细菌物种的平均丰度百分比。 这些数据将被总结并以直方图的形式呈现。

针对特定目标 3

1. 将开发 OTU、临床状态（COPD/HIV）和/或临床数据之间的多变量模型。 这将通过对每个连续变量和二元结果执行一般线性回归来实现。 为了建立OTU和一组临床数据之间的关系，将进行典型对应分析。

   对于微生物组数据集，分析中将包含至少 10% 的样本中存在的 OTU。 对于临床数据集，所有样本中超过 50% 的变量将被排除，以尽量减少缺失值的影响。 共线性将使用微生物组和临床变量的成对 Pearson 相关性检验来解决。 重要的模型组件将通过使用 SIMCA-P 中默认标准的自动拟合选项进行交叉验证来选择（Wang，Bafadhel 等人，2016 年）。

2. 测量 OTU、HIV、COPD 状态和临床数据之间的关联 将通过各个 OTU 的相关性建立共现网络。 成对 Pearson 相关性检验将用于评估共现关系的显着性，并且仅保留显着相关性（调整后的 P 值 < 0.05）。 将始终使用错误发现率 (FDR) 方法来调整 P 值（adj. P) 用于多项测试 (Wang, Bafadhel et al. 2016)。 分数不在引导分布的 95% 置信区间内的不稳定边缘将从网络中移除。 相关性计算中将忽略缺失值。 对于 OTU 网络，100 个排名靠前的边和 100 个排名靠后的边将显示在最终网络中 (Wang, Bafadhel et al. 2016)。

研究限制

在这项研究中，我们的调查范围将涉及肺部的细菌群落，研究人员将通过 16SrRNA 测序鉴定这些细菌群落。 研究人员承认，其他微生物群落（病毒、真菌和寄生虫）可能在 COPD 发病机制和恶化中发挥作用。

道德考量

该研究得到了乌干达国家科学技术委员会 (UNCST) 和穆拉戈医院研究伦理委员会 (MHREC) 的批准。 没有对参与者进行侵入性手术，所有筛查都将包括标准的护理点方法。

知情同意过程：

保密

参与者将获得唯一的识别号码，以替换他们的身份数据。 参与者数据不会附加任何参与者标识符。 研究人员将有权访问原始数据。 所有数据都将存储在受密码保护、完全加密的数据库中，只有负责分析的研究人员和调查人员可以访问。