Determinazione delle comunità batteriche nei polmoni di individui affetti da HIV con BPCO in Uganda. (LMB)

Sfondo

I miglioramenti nell'accesso alla terapia antiretrovirale (ART) tra le persone affette da HIV/AID (PLWHA) hanno portato a una diminuzione della morbilità e della mortalità associate all'HIV. Ciò è particolarmente vero nei paesi a basso e medio reddito (LMIC), che sopportano il carico maggiore di HIV. La riduzione della mortalità ha notevolmente aumentato l'aspettativa di vita, con stime tra PLWHA che ora si avvicinano a quelle della popolazione generale (Asiki, Reniers et al. 2016). Di conseguenza, c'è stata una maggiore attenzione tra i sopravvissuti al carico emergente di malattie non trasmissibili (NCD), come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) (Geneau, Stuckler et al. 2010). L'Africa subsahariana, che ha la più alta densità di PLWHA, ha registrato un aumento drammatico della morbilità e della mortalità correlate alla BPCO (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Sono urgentemente necessari studi per chiarire ulteriormente la patogenesi della BPCO e per determinare strategie di screening e trattamento ottimali (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Nella popolazione generale sono state dimostrate associazioni tra disbiosi polmonare e fenotipi di esacerbazione della BPCO (Wang, Bafadhel et al. 2016). Tuttavia, non si sa ancora perché i PLWHA abbiano una maggiore prevalenza di BPCO rispetto alla popolazione generale (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Attualmente non esistono dati sul microbioma polmonare nella popolazione generale dell'Africa subsahariana, compreso l'Uganda. È necessario esplorare le dinamiche del microbioma polmonare (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) e chiarire le risposte immuno-mediate responsabili del danno polmonare irreversibile che può seguire la disbiosi polmonare nel contesto dell'HIV infezione (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Comprendere il ruolo della disbiosi polmonare nella patogenesi della BPCO associata all'HIV è della massima importanza nel contesto africano con il più alto carico di HIV/AID (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Ipotesi di studio

Il microbioma polmonare alterato negli individui con infezione da HIV è associato alla broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO).

Obiettivi specifici

1. Per determinare il microbioma polmonare tra individui con infezione da HIV e non infetti senza BPCO (controlli sani).
2. Per determinare il microbioma polmonare tra gli individui con infezione da HIV con BPCO.
3. Confrontare il microbioma polmonare tra individui con infezione da HIV con BPCO e individui HIV negativi con BPCO.
4. Per determinare l'associazione tra microbioma polmonare e BPCO in individui con infezione da HIV.

Dichiarazione problema

Mentre nel mondo occidentale sono attualmente in corso molteplici studi sul microbioma polmonare e sul suo ruolo nelle riacutizzazioni della BPCO (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), vi è un numero limitato di letteratura sul ruolo dell'HIV nella patogenesi della BPCO (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Non è ancora noto il motivo per cui gli individui con infezione da HIV sviluppino la BPCO con una prevalenza maggiore rispetto alle loro controparti HIV-negative (Morris, George et al. 2011). Attualmente non esistono dati sul microbioma polmonare nella popolazione generale dell'Africa subsahariana, compreso l'Uganda. La ricerca è urgentemente necessaria per descrivere il microbioma polmonare in individui senza BPCO e per chiarire la patogenesi della BPCO nell'HIV (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Giustificazione

Stabilire un'associazione tra il microbioma polmonare e la BPCO associata all'HIV è della massima importanza nel contesto africano con il più alto carico di HIV/AIDS. Le conoscenze derivanti da tale studio guideranno lo sviluppo di strategie ottimali di screening e trattamento della BPCO nella popolazione HIV.

Metodi

Verrà condotto uno studio trasversale tra gli individui con infezione da HIV che frequentano le cliniche ART a Nakaseke e gli individui HIV negativi dallo studio LiNK (Lung function in Nakaseke).

Dimensione stimata del campione

Applicazione della verifica delle ipotesi e dei calcoli di potenza per i dati del microbioma umano basati sulla tassonomia utilizzando il pacchetto statistico Human Microbiome project-R (HMP-R) (versione 1.4.3) che opera sul modello multinomiale di Dirichlet[33], per il livello di significatività (alfa fissato a = 5%), numero di partecipanti N = 50; numero di letture della sequenza ≥20.000 (considerato come interrotto per il controllo di qualità), potenza ≥99,99% (questa potenza è sufficiente per rilevare la dimensione dell'effetto che si prevede venga osservata nei dati della sequenza). Considerando un tasso di non partecipazione del 20%, la dimensione del campione per ciascun gruppo sarà di 63 partecipanti.

Selezione del sito di studio

Le cliniche ART del distretto di Nakaseke sono state scelte come sede dello studio a causa dello studio BPCO/HIV in corso i cui obiettivi sono determinare la prevalenza ei fattori associati alla BPCO nell'HIV. Oltre 752 individui con infezione da HIV sono stati sottoposti a screening per la BPCO seguendo le linee guida standard. Inoltre, a Nakaseke è stato condotto anche lo studio LiNK (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley). Si trattava di uno studio osservazionale basato sulla popolazione che valutava la prevalenza, i fattori di rischio e la sintomatologia della BPCO nelle comunità rurali di Nakaseke utilizzando un campione casuale stratificato di 1000 individui di età superiore ai 35 anni e residenti a tempo pieno a Nakaseke.

Procedura di campionamento

Utilizzando il generatore di numeri casuali dello strumento Epi (La Rosa, Brooks et al. 2012), il personale dello studio selezionerà 63 partecipanti nei gruppi target dalle nostre rispettive coorti. L'assistente di ricerca documenterà la loro età, sesso e storia del fumo. Il gruppo BPCO + HIV + verrà utilizzato per identificare i partecipanti di altri gruppi.

Piano di studio

Assistenti di ricerca qualificati e un ufficiale medico avranno sede presso le cliniche ART di Nakaseke. I partecipanti selezionati a caso verranno contattati telefonicamente. Il team di studio spiegherà il protocollo ai partecipanti e, se interessati, sarà programmata una visita di studio da parte dell'assistente di ricerca. Otterranno il consenso informato dai partecipanti e verrà eseguita una spirometria di base. Il personale dello studio eseguirà la procedura di induzione dell'espettorato seguendo le procedure operative standard. I campioni di espettorato indotto verranno raccolti utilizzando i kit di raccolta, conservazione e isolamento del DNA dell'espettorato seguendo le istruzioni del produttore. I componenti del conservante consentiranno di conservare i campioni raccolti per più di 2 anni senza alcuna degradazione rilevabile del DNA.

Manipolazione del campione

Il campione verrà trattato secondo le procedure operative standard. In breve, i campioni di espettorato verranno inseriti in un sacchetto a rischio biologico a tenuta stagna con coperchi sigillati e materiale assorbente. Tutti i campioni saranno trasportati in conformità con le normative locali e nazionali che disciplinano il trasporto di materiali potenzialmente infetti.

Laboratorio centrale per l'elaborazione dei campioni

Il laboratorio di diagnostica molecolare e il laboratorio di biorepository integrato situato presso il Makerere University College of Health Sciences al 3° piano dell'edificio di microbiologia medica saranno utilizzati per l'elaborazione dei campioni.

Estrazione del DNA genomico

Il DNA genomico batterico sarà estratto da 200 microlitri di campioni di espettorato utilizzando kit disponibili in commercio.

Controlli di estrazione del DNA genomico

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard verrà utilizzato come controllo positivo del campione durante la preparazione dei campioni di DNA. Il tampone di conservazione del kit di raccolta del DNA senza l'aggiunta di campioni verrà utilizzato come controllo negativo.

Amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) della regione ipervariabile V3 e V4

Le regioni ipervariabili V3 e V4 del gene 16S rRNA saranno amplificate mediante PCR utilizzando primers disponibili in commercio.

Sequenziamento dell'rRNA 16S

Il sequenziamento del DNA verrà eseguito in lotti utilizzando la piattaforma di sequenziamento MiSeq seguendo il protocollo del produttore. Ogni lotto sarà composto da campioni randomizzati dei due gruppi. Verrà eseguita una corsa MiSeq 1x26 per controllare la densità dei cluster e la normalizzazione dei campioni. Il flusso di lavoro di metagenomica Illumina di MiSeq Reporter versione 2.3 verrà utilizzato per il demultiplex delle letture indicizzate, la generazione di file di sequenza e la classificazione delle letture. Verranno utilizzati criteri rigorosi per rimuovere le letture di bassa qualità e chimeriche.

analisi statistica

Per obiettivo specifico 1, 2 e 3

1. Il clustering della sequenza 16SrRNA legge nelle OTU:

   Dopo il controllo di qualità e la pulizia dei dati, le letture rimanenti saranno sottoposte a una raccolta di unità tassonomiche operative (OTU) di riferimento aperto (97% di cut-off dell'identità) in cui le letture verranno prima raggruppate rispetto alle sequenze di riferimento di Greengenes. Le OTU saranno rarefatte al numero più basso di letture tra tutti i campioni e la tabella OTU rarefatta verrà utilizzata per valutare la diversità alfa e beta . Verrà eseguita un'analisi delle coordinate principali (PCoA) a jackknifing per valutare la robustezza dei risultati.

2. Composizione del microbioma polmonare nel bersaglio rispetto ai gruppi di controllo:

Gli investigatori calcoleranno l'abbondanza percentuale media di tutti i cluster tassonomici identificati (OTU) o specie batteriche nella popolazione target rispetto al gruppo di controllo. Questi dati saranno riassunti e presentati in un istogramma.

Per scopo specifico 3

1. Verrà sviluppato un modello multivariato tra OTU, stato clinico (BPCO/HIV) e/o dati clinici. Ciò sarà ottenuto eseguendo una regressione lineare generale per ciascuna variabile continua e il risultato binario. Per stabilire la relazione tra OTU e un gruppo di dati clinici, verrà eseguita un'analisi di corrispondenza canonica.

   Per il set di dati del microbioma, nell'analisi saranno incluse le OTU che saranno presenti in almeno il 10% di tutti i campioni. Per il set di dati clinici, le variabili che mancheranno in più del 50% di tutti i campioni saranno escluse per ridurre al minimo gli effetti dei valori mancanti. La collinearità sarà affrontata utilizzando il test di correlazione di Pearson a coppie su microbioma e variabili cliniche. I componenti significativi del modello saranno selezionati mediante convalida incrociata utilizzando l'opzione Auto-fit con criteri predefiniti nel SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Misurazione dell'associazione tra OTU, HIV, stato di BPCO e dati clinici Una rete di co-occorrenze sarà stabilita dalla correlazione delle singole OTU. Il test di correlazione Pairwise di Pearson verrà utilizzato per valutare il significato delle relazioni di co-occorrenza e verranno mantenute solo le correlazioni significative (valore P aggiustato <0,05). Il metodo False Discovery Rate (FDR) verrà utilizzato per regolare i valori P (adj. P) per test multipli (Wang, Bafadhel et al. 2016). I bordi instabili i cui punteggi non rientreranno nell'intervallo di confidenza del 95% della distribuzione bootstrap verranno rimossi dalla rete. I valori mancanti verranno omessi dai calcoli di correlazione. Per la rete OTU, nella rete finale verranno visualizzati i 100 spigoli di livello superiore e 100 di livello inferiore (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Limiti dello studio

In questo studio, l'ambito delle nostre indagini coinvolgerà le comunità batteriche nei polmoni che i ricercatori identificheranno mediante il sequenziamento del 16SrRNA. I ricercatori riconoscono che altre comunità microbiche (virali, fungine e parassitarie) possono svolgere un ruolo nella patogenesi e nella riacutizzazione della BPCO.

Considerazione etica

Lo studio è stato approvato dall'Uganda National Council of Science and Technology (UNCST) e dal Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC). Non vengono eseguite procedure invasive per i partecipanti e tutto lo screening includerà approcci point of care standard.

Processo di consenso informato:

Riservatezza

Ai partecipanti verranno assegnati numeri di identificazione univoci per sostituire i loro dati identificabili. Nessun identificativo del partecipante verrà allegato ai dati del partecipante. Il personale dello studio avrà accesso ai dati grezzi. Tutti i dati saranno archiviati in un database protetto da password, completamente crittografato, accessibile solo al personale dello studio e ai ricercatori responsabili dell'analisi.