Bestemmelse av bakteriesamfunn i lungene til HIV-infiserte individer med KOLS i Uganda. (LMB)

Bakgrunn

Forbedringene i tilgang til antiretroviral terapi (ART) blant mennesker som lever med HIV/AIDs (PLWHA) har resultert i en reduksjon i HIV-assosiert sykelighet og dødelighet. Dette gjelder spesielt i lav- og mellominntektsland (LMIC), som bærer den største byrden av HIV. Reduksjonen i dødelighet har økt forventet levealder betydelig, med estimater blant PLWHA som nå nærmer seg den for den generelle befolkningen (Asiki, Reniers et al. 2016). Følgelig har det vært økt oppmerksomhet blant overlevende til den nye byrden av ikke-smittsomme sykdommer (NCD), slik som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) (Geneau, Stuckler et al. 2010). Afrika sør for Sahara, som har den høyeste tettheten av PLWHA, har opplevd dramatiske økninger i KOLS-relatert sykelighet og dødelighet (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Studier er påtrengende for å ytterligere belyse patogenesen av KOLS, og for å bestemme optimale screenings- og behandlingsstrategier (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Assosiasjoner mellom lungedysbiose og KOLS-eksaserbasjonsfenotyper er påvist i den generelle befolkningen (Wang, Bafadhel et al. 2016). Det er imidlertid fortsatt ukjent hvorfor PLWHA har høyere prevalens av KOLS sammenlignet med den generelle befolkningen (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Ingen data eksisterer for øyeblikket om lungemikrobiom i den generelle afrikanske befolkningen sør for Sahara, inkludert Uganda. Det er et behov for å utforske dynamikken til lungemikrobiomet (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) og belyse immunmedierte responser som er ansvarlige for irreversibel lungeskade som kan følge lungedysbiose i sammenheng med HIV infeksjon (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Å forstå rollen til lungedysbiose i patogenesen av HIV-assosiert KOLS er av største betydning i afrikanske omgivelser med høyest HIV/AID-byrde (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Studer hypotese

Endret lungemikrobiom hos HIV-infiserte individer er assosiert med kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS).

Spesifikke mål

1. For å bestemme lungemikrobiomet blant HIV-infiserte og uinfiserte individer uten KOLS (friske kontroller).
2. For å bestemme lungemikrobiomet blant HIV-infiserte individer med KOLS.
3. Å sammenligne lungemikrobiom blant HIV-infiserte individer med KOLS og HIV-negative individer med KOLS.
4. For å bestemme sammenhengen mellom lungemikrobiom og KOLS hos HIV-infiserte individer.

Problemstilling

Mens flere studier på lungemikrobiom og dets rolle i KOLS-eksaserbasjoner for tiden utføres i den vestlige verden (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), er det begrenset litteratur om rollen til HIV i KOLS-patogenesen (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Det er fortsatt ukjent hvorfor HIV-infiserte individer utvikler KOLS med høyere prevalens enn deres HIV-negative motparter (Morris, George et al. 2011). Ingen data eksisterer for øyeblikket om lungemikrobiom i den generelle afrikanske befolkningen sør for Sahara, inkludert Uganda. Forskning er påtrengende nødvendig for å beskrive lungemikrobiomet hos individer uten KOLS og for å belyse patogenesen av KOLS ved HIV (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Berettigelse

Å etablere en assosiasjon mellom lungemikrobiom og HIV-assosiert KOLS er av største betydning i den afrikanske settingen med høyest HIV/AID-byrde. Kunnskap fra en slik studie vil veilede utviklingen av optimale screenings- og behandlingsstrategier for KOLS i HIV-populasjonen.

Metoder

En tverrsnittsstudie vil bli utført blant HIV-infiserte individer som går på ART-klinikker i Nakaseke og HIV-negative individer fra lungefunksjon i Nakaseke (LiNK) studien.

Estimert prøvestørrelse

Bruk av hypotesetesting og effektberegninger for taksonomisk-baserte humane mikrobiomdata ved å bruke Human Microbiome project-R (HMP-R) statistisk pakke (versjon1.4.3) som opererer på Dirichlet-multinomialmodellen[33], For signifikansnivå (alfa) satt til = 5 %), antall deltakere N = 50; antall sekvensavlesninger ≥20 000 (betraktes som avbrutt for kvalitetskontroll), effekt ≥99,99 % (denne effekten er tilstrekkelig til å oppdage effektstørrelsen som forventes å bli observert i sekvensdataene). Tatt i betraktning 20 % ikke-deltakelsesrate, vil utvalgsstørrelsen for hver gruppe være 63 deltakere.

Utvalg av studiested

Nakaseke distrikts ART-klinikker har blitt valgt som studiested på grunn av den pågående KOLS/HIV-studien hvis mål er å bestemme prevalensen og faktorer assosiert med KOLS i HIV. Over 752 HIV-infiserte individer har blitt screenet for KOLS etter standard retningslinjer. I tillegg ble LiNK-studien (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) også utført i Nakaseke. Det var en populasjonsbasert observasjonsstudie som vurderte KOLS-prevalens, risikofaktorer og symptomatologi i landlige samfunn i Nakaseke ved å bruke et stratifisert tilfeldig utvalg av 1000 individer over 35 år og heltidsinnbyggere i Nakaseke.

Prøvetakingsprosedyre

Ved hjelp av Epi-verktøyet tilfeldig tallgenerator (La Rosa, Brooks et al. 2012), vil studiepersonalet velge ut 63 deltakere i målgruppene fra våre respektive kohorter. Forskningsassistenten vil dokumentere deres alder, kjønn og røykehistorie. KOLS+HIV+-gruppen vil bli brukt til å identifisere deltakere fra andre grupper.

Studieplan

Trente forskningsassistenter og en medisinsk offiser vil være basert på Nakaseke ART-klinikker. Tilfeldig utvalgte deltakere vil bli kontaktet på telefon. Studieteamet vil forklare protokollen til deltakerne, og hvis interessert, vil et studiebesøk planlegges av forskningsassistenten. De vil innhente informert samtykke fra deltakerne og en baseline spirometri vil bli utført. Studiepersonalet vil utføre sputuminduksjonsprosedyre etter standard operasjonsprosedyrer. Induserte sputumprøver vil bli samlet ved bruk av sputum-DNA-innsamlings-, konserverings- og isolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner. Komponentene i konserveringsmidlet gjør at de innsamlede prøvene kan lagres i mer enn 2 år uten noen påvisbar DNA-nedbrytning.

Prøvehåndtering

Prøver vil bli håndtert i henhold til standard driftsprosedyrer. Kort fortalt vil sputumprøver plasseres i en lekkasjesikker biofarepose med forseglede lokk og absorberende materiale. Alle prøver vil bli transportert i samsvar med lokale og nasjonale forskrifter som regulerer transport av potensielt smittefarlige materialer.

Kjernelaboratorium for prøvebehandling

Molekylærdiagnostikklaboratorium og Integrated Biorepository-laboratorium lokalisert ved Makerere University College of Health Sciences i 3. etasje i Medical Microbiology-bygningen vil bli brukt til prøvebehandling.

Genomisk DNA-ekstraksjon

Bakteriell genomisk DNA vil bli ekstrahert fra 200 mikroliter sputumprøver ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett.

Genomisk DNA-ekstraksjonskontroller

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard vil bli brukt som en positiv prøvekontroll ved klargjøring av DNA-prøver. Lagringsbuffer fra DNA-samlingssett uten tilsatt prøve vil bli brukt som negativ kontroll.

V3 og V4 hypervariabel region polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon

Den hypervariable V3- og V4-regionen til 16S rRNA-genet vil bli PCR-amplifisert ved å bruke kommersielt tilgjengelige primere.

16S rRNA-sekvensering

DNA-sekvensering vil bli utført i batcher ved å bruke MiSeq-sekvenseringsplattformen i henhold til produsentens protokoll. Hver batch vil bestå av randomiserte prøver fra de to gruppene. En 1x26 MiSeq-kjøring vil bli utført for å sjekke klyngetetthet og normalisering av prøver. Illumina metagenomics arbeidsflyt av MiSeq Reporter versjon 2.3 vil bli brukt for demultipleksing av indekserte lesinger, generering av sekvensfiler og klassifisering av lesninger. Strenge kriterier vil bli brukt for å fjerne lavkvalitets og kimære avlesninger.

Statistisk analyse

For spesifikke mål 1, 2 og 3

1. Clustering av 16SrRNA-sekvens leses inn i OTUer:

   Etter kvalitetskontroll og datarensing vil de gjenværende avlesningene bli utsatt for en åpen referanseoperasjonell taksonomisk enhet (OTU)-plukking (97 % identitetsavskjæring) der avlesningene først vil bli gruppert mot Greengenes-referansesekvensene. OTU-er vil bli sjeldne til det laveste antallet avlesninger blant alle prøver, og den sjeldne OTU-tabellen vil bli brukt til å vurdere alfa- og beta-diversitet. En jack-knifing Principal Coordinate Analysis (PCoA) vil bli utført for å vurdere robustheten til resultatene.

2. Sammensetning av lungemikrobiomet i målet sammenlignet med kontrollgrupper:

Etterforskerne vil beregne gjennomsnittlig prosentvis overflod av alle identifiserte taksonomiske klynger OTUer) eller bakteriearter i målpopulasjonen kontra kontrollgruppen. Disse dataene vil bli oppsummert og presentert i histogram.

For spesifikke mål 3

1. En multivariat modell mellom OTU, klinisk status (KOLS/HIV) og/eller kliniske data vil bli utviklet. Dette vil oppnås ved å utføre en generell lineær regresjon for hver kontinuerlig variabel og det binære utfallet. For å etablere forholdet mellom OTUer og en gruppe kliniske data, vil en kanonisk korrespondanseanalyse bli utført.

   For mikrobiom-datasettet vil OTU-er som vil være tilstede i minst 10 % av alle prøver, inkluderes i analysen. For det kliniske datasettet vil variabler som vil mangle i mer enn 50 % av alle prøvene bli ekskludert for å minimere effekten av manglende verdier. Kollinearitet vil bli adressert ved hjelp av parvis Pearsons korrelasjonstest på mikrobiom og kliniske variabler. Signifikante modellkomponenter vil bli valgt ved kryssvalidering ved å bruke alternativet Autotilpasning med standardkriterier i SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Måling av assosiasjon mellom OTUer, HIV, KOLS-status og kliniske data Et samforekomstnettverk vil bli etablert ved korrelasjon av individuelle OTUer. Parvis Pearsons korrelasjonstest vil bli brukt for å vurdere betydningen av samforekomstforhold, og kun signifikante korrelasjoner vil beholdes (justert P-verdi < 0,05). Metoden False Discovery Rate (FDR) vil bli brukt gjennomgående for å justere P-verdier (adj. P) for flere tester (Wang, Bafadhel et al. 2016). Ustabile kanter hvis poengsum ikke vil være innenfor 95 % konfidensintervall for oppstartsdistribusjon vil bli fjernet fra nettverket. Manglende verdier vil bli utelatt fra korrelasjonsberegninger. For OTU-nettverket vil de 100 topprangerte og 100 nederste kantene vises i det endelige nettverket (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Studiebegrensninger

I denne studien vil omfanget av undersøkelsene våre involvere bakteriesamfunn i lungene som etterforskerne vil identifisere ved 16SrRNA-sekvensering. Etterforskerne erkjenner at andre mikrobesamfunn (virale, sopp og parasitter) kan spille en rolle i KOLS-patogenese og forverring.

Etisk hensyn

Studien ble godkjent av Uganda National Council of Science and Technology (UNCST) og Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC). Ingen invasive prosedyrer blir utført for deltakerne, og all screening vil inkludere standard behandlingstilnærminger.

Prosess for informert samtykke:

konfidensialitet

Deltakerne vil få unike identifikasjonsnumre for å erstatte identifiserbare data. Ingen deltakeridentifikatorer vil bli knyttet til deltakerdata. Studieansatte vil ha tilgang til rådata. Alle data vil bli lagret i en passordbeskyttet, fullstendig kryptert database, kun tilgjengelig for studiepersonell og etterforskere som er ansvarlige for analyse.