Bestimmung bakterieller Gemeinschaften in der Lunge von HIV-infizierten Personen mit COPD in Uganda. (LMB)

Hintergrund

Der verbesserte Zugang zu antiretroviraler Therapie (ART) bei Menschen mit HIV/AIDs (PLWHA) hat zu einem Rückgang der HIV-assoziierten Morbidität und Mortalität geführt. Dies gilt insbesondere für Länder mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs), die die größte Last von HIV tragen. Die Verringerung der Sterblichkeit hat die Lebenserwartung erheblich erhöht, wobei sich die Schätzungen unter Menschen mit HIV jetzt denen der Allgemeinbevölkerung annähern (Asiki, Reniers et al. 2016). Infolgedessen haben die Überlebenden der aufkommenden Belastung durch nicht übertragbare Krankheiten (NCD) wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt (Geneau, Stuckler et al. 2010). Subsahara-Afrika, das die höchste Dichte an Menschen mit HIV aufweist, hat einen dramatischen Anstieg der COPD-bedingten Morbidität und Mortalität erlebt (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Studien sind dringend erforderlich, um die Pathogenese der COPD weiter aufzuklären und optimale Screening- und Behandlungsstrategien festzulegen (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Assoziationen zwischen Lungendysbiose und COPD-Exazerbationsphänotypen wurden in der Allgemeinbevölkerung nachgewiesen (Wang, Bafadhel et al. 2016). Es ist jedoch immer noch unbekannt, warum Menschen mit HIV im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung eine höhere COPD-Prävalenz aufweisen (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Derzeit liegen keine Daten zum Lungenmikrobiom in der allgemeinen afrikanischen Bevölkerung südlich der Sahara, einschließlich Uganda, vor. Es besteht die Notwendigkeit, die Dynamik des Lungenmikrobioms zu erforschen (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) und immunvermittelte Reaktionen aufzuklären, die für irreversible Lungenschäden verantwortlich sind, die einer Lungendysbiose im Rahmen von HIV folgen können Infektion (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Das Verständnis der Rolle der Lungendysbiose bei der Pathogenese der HIV-assoziierten COPD ist in der afrikanischen Umgebung mit der höchsten HIV/AID-Belastung von größter Bedeutung (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Studienhypothese

Ein verändertes Lungenmikrobiom bei HIV-infizierten Personen wird mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) in Verbindung gebracht.

Spezifische Ziele

1. Bestimmung des Lungenmikrobioms bei HIV-infizierten und nicht infizierten Personen ohne COPD (gesunde Kontrollen).
2. Bestimmung des Lungenmikrobioms bei HIV-infizierten Personen mit COPD.
3. Vergleich des Lungenmikrobioms bei HIV-infizierten Personen mit COPD und HIV-negativen Personen mit COPD.
4. Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Lungenmikrobiom und COPD bei HIV-infizierten Personen.

Problemstellung

Während in der westlichen Welt derzeit mehrere Studien zum Lungenmikrobiom und seiner Rolle bei COPD-Exazerbationen durchgeführt werden (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) , gibt es nur wenige Literatur zur Rolle von HIV in der COPD-Pathogenese (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Es ist immer noch unbekannt, warum HIV-infizierte Personen COPD mit einer höheren Prävalenz entwickeln als ihre HIV-negativen Gegenstücke (Morris, George et al. 2011). Derzeit liegen keine Daten zum Lungenmikrobiom in der allgemeinen afrikanischen Bevölkerung südlich der Sahara, einschließlich Uganda, vor. Es besteht dringender Forschungsbedarf, um das Lungenmikrobiom bei Personen ohne COPD zu beschreiben und die Pathogenese der COPD bei HIV aufzuklären (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Rechtfertigung

Die Etablierung eines Zusammenhangs zwischen Lungenmikrobiom und HIV-assoziierter COPD ist im afrikanischen Umfeld mit der höchsten HIV/AID-Belastung von größter Bedeutung. Das Wissen aus einer solchen Studie wird die Entwicklung optimaler Screening- und Behandlungsstrategien für COPD in der HIV-Population leiten.

Methoden

Es wird eine Querschnittsstudie unter HIV-infizierten Personen, die ART-Kliniken in Nakaseke besuchen, und HIV-negativen Personen aus der Lung Function in Nakaseke (LiNK)-Studie durchgeführt.

Geschätzte Stichprobengröße

Anwenden der Hypothesentests und Power-Berechnungen für taxonomisch basierte menschliche Mikrobiomdaten unter Verwendung des Statistikpakets Human Microbiome Project-R (HMP-R) (Version 1.4.3), das auf dem Dirichlet-Multinomial-Modell[33] arbeitet, für das Signifikanzniveau (Alpha = 5%), Teilnehmerzahl N = 50; Anzahl der Sequenz-Reads ≥20.000 (gilt als Grenzwert für die Qualitätskontrolle), Power ≥99,99 % (diese Power reicht aus, um die erwartete Effektgröße in den Sequenzdaten zu erkennen). Unter Berücksichtigung einer Nichtteilnahmequote von 20 % beträgt die Stichprobengröße für jede Gruppe 63 Teilnehmer.

Auswahl des Studienortes

ART-Kliniken des Distrikts Nakaseke wurden aufgrund der laufenden COPD/HIV-Studie als Studienorte ausgewählt, deren Ziel es ist, die Prävalenz und die mit COPD bei HIV verbundenen Faktoren zu bestimmen. Über 752 HIV-infizierte Personen wurden gemäß Standardrichtlinien auf COPD untersucht. Darüber hinaus wurde auch die LiNK-Studie (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) in Nakaseke durchgeführt. Es handelte sich um eine bevölkerungsbezogene Beobachtungsstudie zur Bewertung der COPD-Prävalenz, der Risikofaktoren und der Symptomatologie in ländlichen Gemeinden von Nakaseke unter Verwendung einer stratifizierten Zufallsstichprobe von 1000 Personen über 35 Jahren und Vollzeitbewohnern von Nakaseke.

Probenahmeverfahren

Unter Verwendung des Epi-Tool-Zufallszahlengenerators (La Rosa, Brooks et al. 2012) wählt das Studienpersonal 63 Teilnehmer in den Zielgruppen aus unseren jeweiligen Kohorten aus. Der wissenschaftliche Mitarbeiter dokumentiert Alter, Geschlecht und Rauchergeschichte. Die COPD+HIV+-Gruppe wird verwendet, um Teilnehmer aus anderen Gruppen zu identifizieren.

Studienplan

Ausgebildete Forschungsassistenten und ein medizinischer Offizier werden in den Nakaseke ART-Kliniken stationiert sein. Zufällig ausgewählte Teilnehmer werden telefonisch kontaktiert. Das Studienteam wird den Teilnehmern das Protokoll erklären und bei Interesse wird ein Studienbesuch durch den wissenschaftlichen Mitarbeiter geplant. Sie erhalten eine Einverständniserklärung der Teilnehmer und es wird eine Grundlinien-Spirometrie durchgeführt. Das Studienpersonal führt das Sputum-Induktionsverfahren nach Standardarbeitsanweisungen durch. Induzierte Sputumproben werden unter Verwendung von Sputum-DNA-Sammel-, Konservierungs- und Isolierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt. Die Bestandteile des Konservierungsmittels ermöglichen eine Lagerung der gesammelten Proben von mehr als 2 Jahren ohne nachweisbaren DNA-Abbau.

Umgang mit Proben

Die Proben werden gemäß den Standardarbeitsanweisungen behandelt. Kurz gesagt, Sputumproben werden in einen auslaufsicheren Biogefährdungsbeutel mit versiegelten Deckeln und absorbierendem Material gegeben. Alle Proben werden in Übereinstimmung mit den örtlichen und nationalen Vorschriften zum Transport potenziell infektiöser Materialien transportiert.

Kernlabor für Probenbearbeitung

Das Labor für Molekulardiagnostik und das integrierte Biorepository-Labor am Makerere University College of Health Sciences im 3. Stock des Gebäudes für medizinische Mikrobiologie werden für die Probenverarbeitung genutzt.

Genomische DNA-Extraktion

Bakterielle genomische DNA wird aus 200 Mikrolitern Sputumproben mit handelsüblichen Kits extrahiert.

Kontrollen der genomischen DNA-Extraktion

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard wird als positive Probenkontrolle bei der Vorbereitung von DNA-Proben verwendet. Lagerungspuffer aus dem DNA-Sammelkit ohne hinzugefügte Probe wird als Negativkontrolle verwendet.

V3- und V4-Amplifikation der hypervariablen Region der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Die hypervariablen Regionen V3 und V4 des 16S-rRNA-Gens werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Primern PCR-amplifiziert.

16S-rRNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung wird in Chargen unter Verwendung der MiSeq-Sequenzierungsplattform gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Jede Charge besteht aus randomisierten Proben aus den beiden Gruppen. Es wird ein 1x26-MiSeq-Lauf durchgeführt, um die Clusterdichte und die Normalisierung der Proben zu überprüfen. Illumina Metagenomics Workflow by MiSeq Reporter Version 2.3 wird zum Demultiplexen von indizierten Reads, Generieren von Sequenzdateien und Klassifizieren von Reads verwendet. Strenge Kriterien werden verwendet, um minderwertige und chimäre Lesevorgänge zu entfernen.

statistische Analyse

Für spezifisches Ziel 1, 2 und 3

1. Clustering der 16SrRNA-Sequenz liest in OTUs:

   Nach der Qualitätskontrolle und Datenbereinigung werden die verbleibenden Reads einer Open Reference Operational Taxonomical Unit (OTU) Picking (97 % Identity Cut-off) unterzogen, bei der die Reads zunächst gegen die Greengenes-Referenzsequenzen geclustert werden. OTUs werden auf die niedrigste Anzahl von Reads unter allen Proben verdünnt, und die verdünnte OTU-Tabelle wird zur Bewertung der Alpha- und Beta-Diversität verwendet . Zur Beurteilung der Robustheit der Ergebnisse wird eine Jack-Knifing-Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) durchgeführt.

2. Zusammensetzung des Lungenmikrobioms im Target im Vergleich zu Kontrollgruppen:

Die Ermittler berechnen die durchschnittliche prozentuale Häufigkeit aller identifizierten taxonomischen Cluster (OTUs) oder Bakterienarten in der Zielpopulation im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese Daten werden zusammengefasst und in einem Histogramm dargestellt.

Für konkretes Ziel 3

1. Ein multivariates Modell zwischen OTUs, klinischem Status (COPD/HIV) und/oder klinischen Daten wird entwickelt. Dies wird erreicht, indem eine allgemeine lineare Regression für jede kontinuierliche Variable und das binäre Ergebnis durchgeführt wird. Um die Beziehung zwischen OTUs und einer Gruppe klinischer Daten herzustellen, wird eine kanonische Korrespondenzanalyse durchgeführt.

   Für den Mikrobiom-Datensatz werden OTUs, die in mindestens 10 % aller Proben vorhanden sind, in die Analyse einbezogen. Für den klinischen Datensatz werden Variablen, die in mehr als 50 % aller Proben fehlen, ausgeschlossen, um die Auswirkungen fehlender Werte zu minimieren. Die Kollinearität wird mit dem paarweisen Pearson-Korrelationstest für Mikrobiom und klinische Variablen untersucht. Signifikante Modellkomponenten werden durch Kreuzvalidierung unter Verwendung der Auto-Fit-Option mit Standardkriterien in SIMCA-P ausgewählt (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Messung des Zusammenhangs zwischen OTUs, HIV-, COPD-Status und klinischen Daten Durch Korrelation einzelner OTUs wird ein Kookkurrenz-Netzwerk aufgebaut. Der Korrelationstest nach Pearson wird verwendet, um die Signifikanz von Kookkurrenzbeziehungen zu bewerten, und nur signifikante Korrelationen werden beibehalten (angepasster P-Wert < 0,05). Die False Discovery Rate (FDR)-Methode wird durchgehend verwendet, um die P-Werte (adj. P) für multiple Tests (Wang, Bafadhel et al. 2016). Instabile Kanten, deren Werte nicht innerhalb des Konfidenzintervalls von 95 % der Bootstrap-Verteilung liegen, werden aus dem Netzwerk entfernt. Fehlende Werte werden bei Korrelationsberechnungen weggelassen. Für das OTU-Netzwerk werden die 100 höchstrangigen und 100 niedrigstrangigen Kanten im endgültigen Netzwerk angezeigt (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Studienbeschränkungen

In dieser Studie wird der Umfang unserer Untersuchungen Bakteriengemeinschaften in der Lunge umfassen, die die Forscher durch 16SrRNA-Sequenzierung identifizieren werden. Die Forscher erkennen an, dass andere Mikrobengemeinschaften (Viren, Pilze und Parasiten) eine Rolle bei der COPD-Pathogenese und -Exazerbation spielen können.

Ethische Betrachtung

Die Studie wurde vom Uganda National Council of Science and Technology (UNCST) und dem Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC) genehmigt. An den Teilnehmern werden keine invasiven Verfahren durchgeführt, und alle Screenings umfassen standardmäßige Point-of-Care-Ansätze.

Einwilligungsprozess:

Vertraulichkeit

Die Teilnehmer erhalten eindeutige Identifikationsnummern, um ihre identifizierbaren Daten zu ersetzen. An die Teilnehmerdaten werden keine Teilnehmerkennungen angehängt. Das Studienpersonal erhält Zugang zu den Rohdaten. Alle Daten werden in einer passwortgeschützten, vollständig verschlüsselten Datenbank gespeichert, auf die nur das Studienpersonal und die für die Analyse verantwortlichen Forscher zugreifen können.