Určení bakteriálních komunit v plicích jedinců infikovaných HIV s CHOPN v Ugandě. (LMB)

Pozadí

Zlepšení přístupu k antiretrovirové terapii (ART) mezi lidmi žijícími s HIV/AIDS (PLWHA) vedlo ke snížení morbidity a mortality spojené s HIV. To platí zejména v zemích s nízkými a středními příjmy (LMIC), které nesou největší zátěž HIV. Snížení úmrtnosti podstatně prodloužilo očekávanou délku života, přičemž odhady mezi PLWHA se nyní blíží odhadům běžné populace (Asiki, Reniers et al. 2016). V důsledku toho byla mezi přeživšími věnována zvýšená pozornost vznikající zátěži nepřenosných nemocí (NCD), jako je chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) (Geneau, Stuckler et al. 2010). Subsaharská Afrika, která má nejvyšší hustotu PLWHA, zaznamenala dramatický nárůst nemocnosti a mortality související s CHOPN (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). K dalšímu objasnění patogeneze CHOPN a stanovení optimálních strategií screeningu a léčby jsou naléhavě nutné studie (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Asociace mezi plicní dysbiózou a fenotypy exacerbace CHOPN byly prokázány v běžné populaci (Wang, Bafadhel et al. 2016). Stále však není známo, proč mají PLWHA vyšší prevalenci CHOPN ve srovnání s běžnou populací (Drummond, Kunisaki et al. 2016). V současné době neexistují žádné údaje o plicním mikrobiomu v obecné populaci subsaharské Afriky včetně Ugandy. Je potřeba prozkoumat dynamiku plicního mikrobiomu (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) a objasnit imunitně zprostředkované reakce odpovědné za nevratné poškození plic, které může následovat plicní dysbiózu v prostředí HIV. infekce (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Pochopení role plicní dysbiózy v patogenezi CHOPN související s HIV má v africkém prostředí s nejvyšší zátěží HIV/AIDS mimořádný význam (Cassol, Cassetta a kol. 2010, Morris, George a kol. 2011).

Studujte hypotézu

Změněný plicní mikrobiom u jedinců infikovaných HIV je spojen s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN).

Konkrétní cíle

1. Stanovit plicní mikrobiom mezi HIV infikovanými a neinfikovanými jedinci bez CHOPN (zdravé kontroly).
2. Stanovit plicní mikrobiom u jedinců infikovaných HIV s CHOPN.
3. Porovnat plicní mikrobiom mezi HIV infikovanými jedinci s CHOPN a HIV negativními jedinci s CHOPN.
4. Stanovit souvislost mezi plicním mikrobiomem a CHOPN u jedinců infikovaných HIV.

Problémové prohlášení

Zatímco v západním světě se v současné době provádí četné studie o plicním mikrobiomu a jeho úloze při exacerbacích CHOPN (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), existuje jen omezená literaturu o roli HIV v patogenezi CHOPN (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Stále není známo, proč se u jedinců infikovaných HIV rozvine CHOPN s prevalencí vyšší než u jejich HIV negativních protějšků (Morris, George et al. 2011). V současné době neexistují žádné údaje o plicním mikrobiomu v obecné populaci subsaharské Afriky včetně Ugandy. Je naléhavě zapotřebí výzkum k popisu plicního mikrobiomu u jedinců bez CHOPN a k objasnění patogeneze CHOPN u HIV (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Odůvodnění

Stanovení vztahu mezi plicním mikrobiomem a CHOPN související s HIV je nanejvýš důležité v africkém prostředí s nejvyšší zátěží HIV/AIDS. Poznatky z takové studie budou vodítkem pro vývoj optimálních screeningových a léčebných strategií CHOPN u HIV populace.

Metody

Bude provedena průřezová studie mezi jednotlivci infikovanými HIV navštěvujícími kliniky ART v Nakaseke a HIV negativními jedinci ze studie Lung function in Nakaseke (LiNK).

Odhadovaná velikost vzorku

Použití testování hypotéz a výpočtů síly pro data lidského mikrobiomu založená na taxonomii pomocí statistického balíčku Human Microbiome project-R (HMP-R) (verze 1.4.3), který funguje na Dirichletově multiinomickém modelu[33], pro hladinu významnosti (alfa stanoveno na = 5 %), počet účastníků N = 50; počet čtení sekvence ≥20 000 (považováno za přerušené pro kontrolu kvality), síla ≥99,99 % (tato síla je dostatečná pro detekci velikosti účinku, která se očekává v sekvenčních datech). Vzhledem k 20% míře neúčasti bude velikost vzorku pro každou skupinu 63 účastníků.

Výběr studijního místa

Okresní kliniky ART v Nakaseke byly vybrány jako místa studie kvůli probíhající studii COPD/HIV, jejímž cílem je určit prevalenci a faktory spojené s CHOPN u HIV. Více než 752 jedinců infikovaných HIV bylo vyšetřeno na CHOPN podle standardních pokynů. Kromě toho byla v Nakaseke provedena také studie LiNK (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley). Jednalo se o populační observační studii hodnotící prevalenci CHOPN, rizikové faktory a symptomatologii ve venkovských komunitách Nakaseke pomocí stratifikovaného náhodného vzorku 1000 jedinců starších 35 let a trvale bydlících v Nakaseke.

Postup odběru vzorků

Pomocí Epi tool generátoru náhodných čísel (La Rosa, Brooks et al. 2012) pracovníci studie vyberou 63 účastníků v cílových skupinách z našich příslušných kohort. Výzkumný asistent bude dokumentovat jejich věk, pohlaví a kuřáckou historii. Skupina COPD+HIV+ bude použita k identifikaci účastníků z jiných skupin.

Studijní plán

Vyškolení výzkumní asistenti a lékař budou sídlit na klinikách Nakaseke ART. Náhodně vybraní účastníci budou kontaktováni telefonicky. Studijní tým účastníkům vysvětlí protokol a v případě zájmu bude výzkumným asistentem naplánována studijní návštěva. Od účastníků získají informovaný souhlas a provede se základní spirometrie. Pracovníci studie provedou proceduru indukce sputa podle standardních operačních postupů. Vzorky indukovaného sputa budou odebrány pomocí souprav pro odběr, konzervaci a izolaci sputa podle pokynů výrobce. Komponenty konzervantu umožní uskladnění odebraných vzorků po dobu delší než 2 roky bez jakékoli detekovatelné degradace DNA.

Manipulace se vzorky

Se vzorkem bude zacházeno podle standardních operačních postupů. Stručně řečeno, vzorky sputa budou umístěny do nepropustného biologického sáčku s utěsněnými víčky a absorpčním materiálem. Všechny vzorky budou přepravovány v souladu s místními a národními předpisy upravujícími přepravu potenciálně infekčních materiálů.

Základní laboratoř pro zpracování vzorků

Pro zpracování vzorků bude sloužit laboratoř molekulární diagnostiky a laboratoř integrovaného biorepozitáře na Makerere University College of Health Sciences ve 3. patře budovy lékařské mikrobiologie.

Extrakce genomové DNA

Bakteriální genomová DNA bude extrahována z 200 mikrolitrů vzorků sputa pomocí komerčně dostupných kitů.

Kontroly extrakce genomové DNA

Standard ZymoBIOMICS Microbial Community Standard bude použit jako pozitivní kontrola vzorku při přípravě vzorků DNA. Skladovací pufr z DNA Collection Kit bez přidaného vzorku bude použit jako negativní kontrola.

Amplifikace V3 a V4 hypervariabilní oblasti polymerázové řetězové reakce (PCR).

Hypervariabilní oblast V3 a V4 genu 16S rRNA bude amplifikována pomocí PCR za použití komerčně dostupných primerů.

16S rRNA sekvenování

Sekvenování DNA bude prováděno v dávkách s využitím sekvenační platformy MiSeq podle protokolu výrobce. Každá šarže se bude skládat z náhodně vybraných vzorků ze dvou skupin. Pro kontrolu hustoty shluků a normalizace vzorků bude proveden běh 1x26 MiSeq. Pracovní postup metagenomiky Illumina od MiSeq Reporter verze 2.3 bude použit pro demultiplexování indexovaných čtení, generování sekvenčních souborů a klasifikaci čtení. K odstranění nekvalitních a chimérických čtení budou použita přísná kritéria.

Statistická analýza

Pro konkrétní cíl 1, 2 a 3

1. Shlukování sekvence 16SrRNA se přečte do OTU:

   Po kontrole kvality a vyčištění dat budou zbývající odečty podrobeny výběru otevřené referenční operační taxonomické jednotky (OTU) (hranice 97% identity), ve které budou odečty nejprve seskupeny proti referenčním sekvencím Greengenes. OTU budou zředěny na nejnižší počet čtení ze všech vzorků a zředěná tabulka OTU bude použita pro posouzení diverzity alfa a beta. K posouzení robustnosti výsledků bude provedena základní souřadnicová analýza (PCoA) metodou jack-knifing.

2. Složení plicního mikrobiomu v cíli ve srovnání s kontrolními skupinami:

Vyšetřovatelé spočítají průměrnou procentuální abundanci všech identifikovaných taxonomických shluků OTU) nebo bakteriálních druhů v cílové populaci oproti kontrolní skupině. Tato data budou shrnuta a prezentována v histogramu.

Pro konkrétní cíl 3

1. Bude vyvinut multivariační model mezi OTU, klinickým stavem (CHOPN/HIV) a/nebo klinickými údaji. Toho bude dosaženo provedením obecné lineární regrese pro každou spojitou proměnnou a binární výsledek. Pro stanovení vztahu mezi OTU a skupinou klinických dat bude provedena kanonická korespondenční analýza.

   U souboru dat mikrobiomu budou do analýzy zahrnuty OTU, které budou přítomny alespoň v 10 % všech vzorků. U klinického souboru dat budou vyloučeny proměnné, které budou chybět ve více než 50 % všech vzorků, aby se minimalizovaly účinky chybějících hodnot. Kolinearita bude řešena pomocí párového Pearsonova korelačního testu na mikrobiomu a klinických proměnných. Významné komponenty modelu budou vybrány křížovou validací pomocí možnosti Auto-fit s výchozími kritérii v SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Měření asociace mezi OTU, HIV, stavem CHOPN a klinickými údaji Korelací jednotlivých OTU bude vytvořena síť společného výskytu. K posouzení významnosti vztahů společného výskytu bude použit Pairwise Pearsonův korelační test, přičemž budou zachovány pouze významné korelace (upravená P-hodnota < 0,05). Metoda False Discovery Rate (FDR) se bude používat k úpravě P-hodnot (adj. P) pro více testů (Wang, Bafadhel et al. 2016). Nestabilní hrany, jejichž skóre nebude v rámci 95% intervalu spolehlivosti distribuce bootstrapu, budou ze sítě odstraněny. Chybějící hodnoty budou z korelačních výpočtů vynechány. U sítě OTU se ve výsledné síti zobrazí 100 nejvyšších a 100 nejnižších hran (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Studijní omezení

V této studii bude rozsah našich výzkumů zahrnovat bakteriální komunity v plicích, které výzkumníci identifikují sekvenováním 16SrRNA. Výzkumníci uznávají, že v patogenezi a exacerbaci CHOPN mohou hrát roli i další mikrobní komunity (virové, houbové a parazité).

Etická úvaha

Studii schválila Ugandská národní rada pro vědu a technologii (UNCST) a etický výbor pro výzkum nemocnice Mulago (MHREC). Účastníkům nejsou prováděny žádné invazivní postupy a veškerý screening bude zahrnovat standardní přístupy v místě péče.

Proces informovaného souhlasu:

Důvěrnost

Účastníci obdrží jedinečná identifikační čísla, která nahradí jejich identifikovatelné údaje. K údajům účastníků nebudou připojeny žádné identifikátory účastníků. Pracovníci studie budou mít přístup k nezpracovaným datům. Všechna data budou uložena v heslem chráněné, plně šifrované databázi, přístupné pouze pracovníkům studie a zkoušejícím odpovědným za analýzu.