Bestemmelse af bakterielle samfund i lungerne hos HIV-inficerede individer med KOL i Uganda. (LMB)

Baggrund

Forbedringerne i adgangen til antiretroviral terapi (ART) blandt mennesker, der lever med hiv/aids (PLWHA) har resulteret i et fald i hiv-associeret sygelighed og dødelighed. Dette gælder især i lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er), som bærer den største byrde af hiv. Reduktionen i dødelighed har øget den forventede levetid væsentligt, hvor estimater blandt PLWHA nu nærmer sig den for den generelle befolkning (Asiki, Reniers et al. 2016). Som følge heraf har der været øget opmærksomhed blandt overlevende på den nye byrde af ikke-smitsomme sygdomme (NCD), såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) (Geneau, Stuckler et al. 2010). Afrika syd for Sahara, som har den højeste tæthed af PLWHA, har oplevet dramatiske stigninger i KOL-relateret morbiditet og dødelighed (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Der er et presserende behov for undersøgelser for yderligere at belyse patogenesen af ​​KOL og for at bestemme optimale screenings- og behandlingsstrategier (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Forbindelser mellem lungedysbiose og KOL-eksacerbationsfænotyper er blevet påvist i den generelle befolkning (Wang, Bafadhel et al. 2016). Det er dog stadig ukendt, hvorfor PLWHA har højere forekomst af KOL sammenlignet med den generelle befolkning (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Der findes i øjeblikket ingen data om lungemikrobiom i den generelle afrikanske befolkning syd for Sahara, inklusive Uganda. Der er behov for at udforske dynamikken i lungemikrobiomet (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) og belyse immunmedierede responser, der er ansvarlige for irreversibel lungeskade, der kan følge lungedysbiose i forbindelse med HIV infektion (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). At forstå lungedysbiosens rolle i patogenesen af ​​HIV-associeret KOL er af største betydning i de afrikanske omgivelser med den højeste HIV/AID-byrde (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Undersøg hypotese

Ændret lungemikrobiom hos HIV-inficerede individer er forbundet med kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL).

Specifikke mål

1. At bestemme lungemikrobiomet blandt HIV-inficerede og uinficerede individer uden KOL (sunde kontroller).
2. At bestemme lungemikrobiomet blandt HIV-inficerede individer med KOL.
3. At sammenligne lungemikrobiom blandt HIV-inficerede individer med KOL og HIV-negative individer med KOL.
4. At bestemme sammenhængen mellem lungemikrobiom og KOL hos HIV-inficerede individer.

Problemformulering

Mens flere undersøgelser af lungemikrobiom og dets rolle i KOL-eksacerbationer i øjeblikket udføres i den vestlige verden (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), er der begrænset litteratur om HIV's rolle i KOL-patogenese (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Det er stadig ukendt, hvorfor hiv-inficerede individer udvikler KOL med en højere prævalens end deres hiv-negative modstykker (Morris, George et al. 2011). Der findes i øjeblikket ingen data om lungemikrobiom i den generelle afrikanske befolkning syd for Sahara, inklusive Uganda. Der er et presserende behov for forskning for at beskrive lungemikrobiomet hos individer uden KOL og for at belyse patogenesen af ​​KOL i HIV (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Begrundelse

Etablering af en sammenhæng mellem lungemikrobiom og HIV-associeret KOL er af største betydning i de afrikanske omgivelser med den højeste HIV/AID-byrde. Viden fra en sådan undersøgelse vil være vejledende i udviklingen af ​​optimale screenings- og behandlingsstrategier for KOL i HIV-populationen.

Metoder

Et tværsnitsstudie vil blive udført blandt HIV-inficerede individer, der går på ART-klinikker i Nakaseke og HIV-negative individer fra lungefunktion i Nakaseke (LiNK) undersøgelse.

Estimeret prøvestørrelse

Anvendelse af hypotesetestning og effektberegninger for taksonomisk-baserede humane mikrobiomdata ved hjælp af Human Microbiome project-R (HMP-R) statistiske pakke (version1.4.3), som opererer på Dirichlet-multinomialmodellen[33], For signifikansniveau (alfa) sat til = 5 %), antal deltagere N = 50; antal sekvensaflæsninger ≥20.000 (betragtes som afbrudt til kvalitetskontrol), effekt ≥99,99 % (denne effekt er tilstrækkelig til at detektere den effektstørrelse, der forventes at blive observeret i sekvensdataene). I betragtning af 20 % ikke-deltagelsesprocent vil stikprøvestørrelsen for hver gruppe være 63 deltagere.

Valg af studiested

Nakaseke-distriktets ART-klinikker er blevet valgt som undersøgelsessteder på grund af det igangværende KOL/HIV-studie, hvis mål er at bestemme prævalensen og faktorer forbundet med KOL i HIV. Over 752 HIV-smittede personer er blevet screenet for KOL efter standardretningslinjer. Derudover blev LiNK-undersøgelsen (Lungefunktion i Nakaseke og Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) også udført i Nakaseke. Det var et befolkningsbaseret observationsstudie, der vurderede KOL-prævalens, risikofaktorer og symptomatologi i landlige samfund i Nakaseke ved hjælp af en stratificeret tilfældig stikprøve på 1000 individer over 35 år og fuldtidsbeboere i Nakaseke.

Prøveudtagningsprocedure

Ved hjælp af Epi-værktøjet tilfældig talgenerator (La Rosa, Brooks et al. 2012) vil undersøgelsespersonalet udvælge 63 deltagere i målgrupperne fra vores respektive kohorter. Forskningsassistenten vil dokumentere deres alder, køn og rygehistorie. KOL+HIV+-gruppen vil blive brugt til at identificere deltagere fra andre grupper.

Studieplan

Uddannede forskningsassistenter og en læge vil være baseret på Nakaseke ART-klinikker. Tilfældigt udvalgte deltagere vil blive kontaktet telefonisk. Undersøgelsesholdet vil forklare protokollen til deltagerne, og hvis det er interesseret, vil forskningsassistenten planlægge et studiebesøg. De vil indhente informeret samtykke fra deltagerne, og en baseline spirometri vil blive udført. Undersøgelsespersonalet vil udføre sputuminduktionsproceduren efter standard operationelle procedurer. Inducerede sputumprøver vil blive indsamlet ved hjælp af sputum-DNA-indsamlings-, konserverings- og isoleringssæt efter producentens instruktioner. Konserveringsmidlets komponenter gør det muligt at opbevare de indsamlede prøver i mere end 2 år uden nogen påviselig DNA-nedbrydning.

Prøvehåndtering

Prøver vil blive håndteret i henhold til standarddriftsprocedurerne. Kort fortalt placeres sputumprøver i en lækagesikker biofarepose med forseglede låg og absorberende materiale. Alle prøver vil blive transporteret i overensstemmelse med lokale og nationale regler for transport af potentielt infektiøse materialer.

Kernelaboratorium til prøvebehandling

Molekylær diagnostisk laboratorium og Integrated Biorepository-laboratorium placeret på Makerere University College of Health Sciences på 3. sal i Medical Microbiology-bygningen vil blive brugt til prøvebehandling.

Genomisk DNA-ekstraktion

Bakteriel genomisk DNA vil blive ekstraheret fra 200 mikroliter sputumprøver ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.

Genomisk DNA-ekstraktionskontroller

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard vil blive brugt som en positiv prøvekontrol ved klargøring af DNA-prøver. Opbevaringsbuffer fra DNA-indsamlingskit uden tilsat prøve vil blive brugt som negativ kontrol.

V3 og V4 hypervariabel region polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation

Den hypervariable V3- og V4-region af 16S rRNA-genet vil blive PCR-amplificeret under anvendelse af kommercielt tilgængelige primere.

16S rRNA-sekventering

DNA-sekventering vil blive udført i batches ved hjælp af MiSeq-sekventeringsplatform efter producentens protokol. Hver batch vil bestå af randomiserede prøver fra de to grupper. En 1x26 MiSeq-kørsel vil blive udført for at kontrollere klyngetæthed og normalisering af prøver. Illumina metagenomics workflow af MiSeq Reporter version 2.3 vil blive brugt til at demultiplexe indekserede læsninger, generere sekvensfiler og klassificere læsninger. Strenge kriterier vil blive brugt til at fjerne lav kvalitet og kimære læsninger.

Statistisk analyse

Til specifikke mål 1, 2 og 3

1. Klyngning af 16SrRNA-sekvens læser ind i OTU'er:

   Efter kvalitetskontrol og datarensning vil de resterende aflæsninger blive udsat for en åben reference operationel taksonomisk enhed (OTU)-plukning (97% identitetsgrænse), hvor aflæsninger først vil blive grupperet mod Greengenes-referencesekvenserne. OTU'er vil blive sjældne til det laveste antal aflæsninger blandt alle prøver, og den sjældne OTU-tabel vil blive brugt til at vurdere alfa- og beta-diversitet. En knivstikkende Principal Coordinate Analysis (PCoA) vil blive udført for at vurdere robustheden af ​​resultaterne.

2. Sammensætning af lungemikrobiomet i målet sammenlignet med kontrolgrupper:

Efterforskerne vil beregne den gennemsnitlige procentvise overflod af alle de identificerede taksonomiske klynger OTU'er) eller bakteriearter i målpopulationen vs. kontrolgruppen. Disse data vil blive opsummeret og præsenteret i histogram.

Til specifikt formål 3

1. En multivariat model mellem OTU'er, klinisk status (KOL/HIV) og/eller kliniske data vil blive udviklet. Dette opnås ved at udføre en generel lineær regression for hver kontinuerlig variabel og det binære udfald. For at etablere forholdet mellem OTU'er og en gruppe af kliniske data vil der blive udført en kanonisk korrespondanceanalyse.

   For mikrobiomdatasættet vil OTU'er, der vil være til stede i mindst 10 % af alle prøver, blive inkluderet i analysen. For det kliniske datasæt vil variabler, der vil mangle i mere end 50 % af alle prøver, blive ekskluderet for at minimere virkningerne af manglende værdier. Kollinearitet vil blive behandlet ved hjælp af parvise Pearsons korrelationstest på mikrobiom og kliniske variabler. Væsentlige modelkomponenter vil blive udvalgt ved krydsvalidering ved hjælp af Auto-fit-indstillingen med standardkriterier i SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Måling af sammenhæng mellem OTU'er, HIV, KOL-status og kliniske data Et netværk for samtidig forekomst vil blive etableret ved korrelation af individuelle OTU'er. Parvis Pearsons korrelationstest vil blive brugt til at vurdere signifikansen af ​​co-forekomst sammenhænge, ​​og kun signifikante korrelationer vil blive bibeholdt (justeret P-værdi < 0,05). Metoden False Discovery Rate (FDR) vil blive brugt hele vejen igennem til at justere P-værdier (adj. P) for flere tests (Wang, Bafadhel et al. 2016). Ustabile kanter, hvis score ikke vil være inden for 95 % konfidensinterval af bootstrap-distribution, vil blive fjernet fra netværket. Manglende værdier vil blive udeladt fra korrelationsberegninger. For OTU-netværket vil de 100 toprangerede og 100 nederste kanter blive vist i det endelige netværk (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Studiebegrænsninger

I denne undersøgelse vil omfanget af vores undersøgelser involvere bakteriesamfund i lungerne, som efterforskerne vil identificere ved 16SrRNA-sekventering. Efterforskerne anerkender, at andre mikrobesamfund (virale, svampe og parasitter) kan spille en rolle i KOL-patogenese og forværring.

Etiske overvejelser

Undersøgelsen blev godkendt af Uganda National Council of Science and Technology (UNCST) og Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC). Der udføres ingen invasive procedurer for deltagerne, og al screening vil omfatte standardbehandlingsmetoder.

Processen for informeret samtykke:

Fortrolighed

Deltagerne vil få unikke identifikationsnumre til at erstatte deres identificerbare data. Ingen deltageridentifikatorer vil blive knyttet til deltagerdata. Studiepersonale vil have adgang til rådata. Alle data vil blive gemt i en adgangskodebeskyttet, fuldt krypteret database, som kun er tilgængelig for undersøgelsespersonalet og efterforskere, der er ansvarlige for analyse.