Określanie społeczności bakteryjnych w płucach osób zakażonych wirusem HIV z POChP w Ugandzie. (LMB)

Tło

Poprawa dostępu do terapii antyretrowirusowej (ART) wśród osób żyjących z HIV/AIDS (PLWHA) spowodowała spadek zachorowalności i śmiertelności związanej z HIV. Jest to szczególnie prawdziwe w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), które ponoszą największe obciążenie HIV. Zmniejszenie śmiertelności znacznie wydłużyło oczekiwaną długość życia, a szacunki wśród PLWHA zbliżają się obecnie do szacunków populacji ogólnej (Asiki, Reniers i in. 2016). W związku z tym wśród osób, które przeżyły, zwrócono większą uwagę na pojawiające się obciążenie chorobami niezakaźnymi (NCD), takimi jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) (Geneau, Stuckler i in. 2010). Afryka Subsaharyjska, która ma największe zagęszczenie PLWHA, doświadczyła dramatycznego wzrostu zachorowalności i śmiertelności związanej z POChP (van Zyl Smit, Pai i wsp. 2010, Asiki, Reniers i wsp. 2016). Pilnie potrzebne są badania w celu dalszego wyjaśnienia patogenezy POChP oraz określenia optymalnych strategii badań przesiewowych i leczenia (Asiki, Reniers i wsp. 2016, Drummond, Kunisaki i wsp. 2016). W populacji ogólnej wykazano związek między dysbiozą płuc a fenotypami zaostrzeń POChP (Wang, Bafadhel i wsp. 2016). Jednak nadal nie wiadomo, dlaczego PLWHA mają wyższą częstość występowania POChP w porównaniu z populacją ogólną (Drummond, Kunisaki i wsp. 2016). Obecnie nie ma danych na temat mikrobiomu płuc w ogólnej populacji Afryki Subsaharyjskiej, w tym w Ugandzie. Istnieje potrzeba zbadania dynamiki mikrobiomu płuc (Cui, Morris i in. 2014, Wang, Bafadhel i in. 2016) i wyjaśnienia odpowiedzi immunologicznych odpowiedzialnych za nieodwracalne uszkodzenie płuc, które może następować po dysbiozie płuc w warunkach HIV infekcja (Hutchinson, Vlahos i in. 2014, Wang, Bafadhel i in. 2016). Zrozumienie roli dysbiozy płuc w patogenezie POChP związanej z HIV ma ogromne znaczenie w środowisku afrykańskim o największym obciążeniu HIV/AIDS (Cassol, Cassetta i wsp. 2010, Morris, George i wsp. 2011).

Hipoteza badawcza

Zmieniony mikrobiom płuc u osób zakażonych wirusem HIV jest związany z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP).

Konkretne cele

1. Określenie mikrobiomu płuc wśród osób zakażonych wirusem HIV i niezakażonych bez POChP (zdrowa grupa kontrolna).
2. Określenie mikrobiomu płuc u osób zakażonych wirusem HIV z POChP.
3. Porównanie mikrobiomu płuc wśród osób zakażonych wirusem HIV z POChP i osób z ujemnym wynikiem HIV z POChP.
4. Określenie związku między mikrobiomem płuc a POChP u osób zakażonych wirusem HIV.

Oświadczenie o problemie

Podczas gdy w świecie zachodnim prowadzi się obecnie wiele badań nad mikrobiomem płuc i jego rolą w zaostrzeniach POChP (Cui, Morris i wsp. 2014, Sze, Hogg i wsp. 2014, Wang, Bafadhel i wsp. 2016), ich liczba jest ograniczona. literatura dotycząca roli HIV w patogenezie POChP (Morris, George i wsp. 2011, Drummond, Kunisaki i wsp. 2016). Nadal nie wiadomo, dlaczego osoby zakażone wirusem HIV zapadają na POChP z częstością występowania POChP niż u osób zakażonych wirusem HIV (Morris, George i wsp. 2011). Obecnie nie ma danych na temat mikrobiomu płuc w ogólnej populacji Afryki Subsaharyjskiej, w tym w Ugandzie. Pilnie potrzebne są badania w celu opisania mikrobiomu płuc u osób bez POChP i wyjaśnienia patogenezy POChP u HIV (Morris, George i wsp. 2011, Drummond, Kunisaki i wsp. 2016).

Uzasadnienie

Ustalenie związku między mikrobiomem płuc a POChP związaną z HIV ma ogromne znaczenie w środowisku afrykańskim o największym obciążeniu HIV/AIDS. Wiedza uzyskana z takiego badania pomoże opracować optymalne strategie badań przesiewowych i leczenia POChP w populacji zakażonej wirusem HIV.

Metody

Badanie przekrojowe zostanie przeprowadzone wśród osób zakażonych wirusem HIV uczęszczających do klinik ART w Nakaseke oraz osób z ujemnym wynikiem testu na obecność wirusa HIV z badania funkcji płuc w Nakaseke (LiNK).

Szacowana wielkość próbki

Zastosowanie testowania hipotez i obliczeń mocy dla danych mikrobiomu ludzkiego opartych na taksonomii przy użyciu pakietu statystycznego Human Microbiome project-R (HMP-R) (wersja 1.4.3), który działa na modelu wielomianowym Dirichleta[33], dla poziomu istotności (alfa ustalona na = 5%), liczba uczestników N = 50; liczba odczytów sekwencji ≥20 000 (uznawana za odciętą dla kontroli jakości), moc ≥99,99% (ta moc jest wystarczająca do wykrycia wielkości efektu, który ma być obserwowany w danych sekwencji). Biorąc pod uwagę 20% wskaźnik braku uczestnictwa, wielkość próby dla każdej grupy wyniesie 63 uczestników.

Wybór miejsca do nauki

Na miejsca badań wybrano kliniki ART dystryktu Nakaseke ze względu na trwające badanie POChP/HIV, którego celem jest określenie częstości występowania i czynników związanych z POChP w przypadku HIV. Ponad 752 osoby zakażone wirusem HIV zostały przebadane pod kątem POChP zgodnie ze standardowymi wytycznymi. Ponadto w Nakaseke przeprowadzono również badanie LiNK (funkcja płuc w Nakaseke i Kampali (LiNK), PI: Kirenga, Checkley). Było to populacyjne badanie obserwacyjne oceniające częstość występowania POChP, czynniki ryzyka i symptomatologię w społecznościach wiejskich Nakaseke przy użyciu stratyfikowanej losowej próby 1000 osób w wieku powyżej 35 lat i pełnoetatowych mieszkańców Nakaseke.

Procedura pobierania próbek

Korzystając z generatora liczb losowych narzędzia Epi (La Rosa, Brooks i in. 2012), personel badawczy wybierze 63 uczestników z grup docelowych z odpowiednich kohort. Asystent naukowy udokumentuje ich wiek, płeć i historię palenia. Grupa POChP+HIV+ zostanie wykorzystana do identyfikacji uczestników z innych grup.

Plan studiów

Wyszkoleni asystenci naukowi i oficer medyczny będą pracować w klinikach Nakaseke ART. Z losowo wybranymi uczestnikami skontaktujemy się telefonicznie. Zespół badawczy wyjaśni uczestnikom protokół, a jeśli jest zainteresowany, asystent naukowy zaplanuje wizytę studyjną. Uzyskają świadomą zgodę od uczestników i zostanie wykonana spirometria wyjściowa. Personel badawczy przeprowadzi procedurę indukcji plwociny zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. Próbki indukowanej plwociny będą pobierane przy użyciu zestawów do pobierania, konserwacji i izolacji DNA plwociny zgodnie z instrukcjami producenta. Składniki konserwantu pozwolą na przechowywanie pobranych próbek przez ponad 2 lata bez wykrywalnej degradacji DNA.

Postępowanie z próbkami

Próbki będą traktowane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. W skrócie, próbki plwociny zostaną umieszczone w nieprzeciekającym worku chroniącym przed zagrożeniem biologicznym z uszczelnionymi wieczkami i materiałem chłonnym. Wszystkie próbki będą transportowane zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami regulującymi transport materiałów potencjalnie zakaźnych.

Główne laboratorium do przetwarzania próbek

Do przetwarzania próbek wykorzystywane będzie laboratorium diagnostyki molekularnej oraz laboratorium Integrated Biorepository znajdujące się w Makerere University College of Health Sciences na 3 piętrze budynku Medical Microbiology.

Ekstrakcja genomowego DNA

Genomowy DNA bakterii zostanie wyekstrahowany z 200 mikrolitrów próbek plwociny przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.

Kontrola ekstrakcji genomowego DNA

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard będzie używany jako kontrola pozytywna podczas przygotowywania próbek DNA. Bufor do przechowywania z zestawu do pobierania DNA bez dodanej próbki zostanie użyty jako kontrola negatywna.

Amplifikacja łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) regionów hiperzmiennych V3 i V4

Regiony hiperzmienne V3 i V4 genu 16S rRNA będą amplifikowane metodą PCR przy użyciu dostępnych w handlu starterów.

Sekwencjonowanie 16S rRNA

Sekwencjonowanie DNA zostanie przeprowadzone partiami z wykorzystaniem platformy sekwencjonowania MiSeq zgodnie z protokołem producenta. Każda partia będzie składać się z losowo dobranych próbek z dwóch grup. Przeprowadzony zostanie przebieg 1x26 MiSeq w celu sprawdzenia gęstości skupień i normalizacji próbek. Przepływ pracy Illumina metagenomics autorstwa MiSeq Reporter w wersji 2.3 będzie używany do demultipleksowania indeksowanych odczytów, generowania plików sekwencji i klasyfikowania odczytów. W celu usunięcia odczytów niskiej jakości i chimerycznych zostaną zastosowane surowe kryteria.

Analiza statystyczna

Dla celu szczegółowego 1, 2 i 3

1. Grupowanie sekwencji 16SrRNA wczytuje się do OTU:

   Po kontroli jakości i oczyszczeniu danych pozostałe odczyty zostaną poddane otwartemu referencyjnemu wybieraniu operacyjnej jednostki taksonomicznej (OTU) (97% odcięcia tożsamości), w którym odczyty zostaną najpierw zgrupowane względem sekwencji referencyjnych Greengenes. OTU zostaną rozrzedzone do najniższej liczby odczytów spośród wszystkich próbek, a tabela rozrzedzonych OTU zostanie wykorzystana do oceny różnorodności alfa i beta. W celu oceny wiarygodności wyników zostanie przeprowadzona analiza podstawowych współrzędnych (PCoA).

2. Skład mikrobiomu płuc w grupie docelowej w porównaniu z grupami kontrolnymi:

Badacze obliczą średnią liczebność procentową wszystkich zidentyfikowanych klastrów taksonomicznych (OTU) lub gatunków bakterii w populacji docelowej w porównaniu z grupą kontrolną. Dane te zostaną podsumowane i przedstawione na histogramie.

W konkretnym celu 3

1. Opracowany zostanie wielowymiarowy model uwzględniający OTU, stan kliniczny (POChP/HIV) i/lub dane kliniczne. Zostanie to osiągnięte poprzez wykonanie ogólnej regresji liniowej dla każdej zmiennej ciągłej i wyniku binarnego. Aby ustalić związek między OTU a grupą danych klinicznych, zostanie przeprowadzona kanoniczna analiza korespondencji.

   W przypadku zestawu danych mikrobiomu w analizie zostaną uwzględnione OTU, które będą obecne w co najmniej 10% wszystkich próbek. W przypadku zestawu danych klinicznych zmienne, których będzie brakować w ponad 50% wszystkich próbek, zostaną wykluczone, aby zminimalizować skutki brakujących wartości. Kolinearność zostanie omówiona za pomocą testu korelacji parami Pearsona dotyczącego mikrobiomu i zmiennych klinicznych. Istotne komponenty modelu zostaną wybrane poprzez walidację krzyżową przy użyciu opcji Autodopasowanie z domyślnymi kryteriami w SIMCA-P (Wang, Bafadhel i in. 2016).

2. Mierzenie związku między OTU, statusem HIV, POChP i danymi klinicznymi Sieć współwystępowania zostanie utworzona poprzez korelację poszczególnych OTU. Test korelacji parami Pearsona zostanie zastosowany do oceny istotności zależności współwystępowania i zachowane zostaną tylko istotne korelacje (skorygowana wartość P < 0,05). W celu dostosowania wartości P (przym. P) dla wielu testów (Wang, Bafadhel i in. 2016). Niestabilne krawędzie, których wyniki nie mieszczą się w 95% przedziale ufności rozkładu ładowania początkowego, zostaną usunięte z sieci. Brakujące wartości zostaną pominięte w obliczeniach korelacji. W przypadku sieci OTU 100 górnych i 100 dolnych krawędzi zostanie wyświetlonych w ostatecznej sieci (Wang, Bafadhel i in. 2016).

Ograniczenia w nauce

W tym badaniu zakres naszych badań obejmie społeczności bakteryjne w płucach, które badacze zidentyfikują za pomocą sekwencjonowania 16SrRNA. Badacze przyznają, że inne społeczności drobnoustrojów (wirusy, grzyby i pasożyty) mogą odgrywać rolę w patogenezie POChP i zaostrzeniach.

Względy etyczne

Badanie zostało zatwierdzone przez Narodową Radę Nauki i Technologii Ugandy (UNCST) oraz Komisję Etyki Badań Szpitala Mulago (MHREC). Uczestnikom nie są wykonywane żadne inwazyjne procedury, a wszystkie badania przesiewowe będą obejmowały standardowe podejście do opieki.

Proces świadomej zgody:

Poufność

Uczestnicy otrzymają unikalne numery identyfikacyjne, które zastąpią ich dane umożliwiające identyfikację. Żadne identyfikatory uczestników nie zostaną dołączone do danych uczestników. Pracownicy naukowi będą mieli dostęp do surowych danych. Wszystkie dane będą przechowywane w chronionej hasłem, w pełni zaszyfrowanej bazie danych, dostępnej tylko dla personelu badawczego i badaczy odpowiedzialnych za analizę.