Bakteriális közösségek meghatározása COPD-s HIV-fertőzött egyének tüdejében Ugandában. (LMB)

Háttér

A HIV/AIDS-ben (PLWHA) élők antiretrovirális terápiához (ART) való hozzáférésének javulása a HIV-vel összefüggő morbiditás és mortalitás csökkenését eredményezte. Ez különösen igaz az alacsony és közepes jövedelmű országokra (LMIC), amelyek a HIV-fertőzés legnagyobb terhét viselik. A halálozás csökkenése jelentősen megnövelte a várható élettartamot, és a PLWHA-k körében végzett becslések már megközelítik a teljes népesség becsléseit (Asiki, Reniers et al. 2016). Következésképpen a túlélők körében fokozott figyelem irányul a nem fertőző betegségek (NCD), például a krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) növekvő terhére (Geneau, Stuckler et al. 2010). A szubszaharai Afrikában, ahol a legnagyobb a PLWHA-sűrűség, a COPD-vel kapcsolatos morbiditás és mortalitás drámai növekedését tapasztalta (van Zyl Smit, Pai és mtsai 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Sürgősen tanulmányokra van szükség a COPD patogenezisének további tisztázásához, valamint az optimális szűrési és kezelési stratégiák meghatározásához (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki és mtsai 2016). A tüdő dysbiosis és a COPD exacerbáció fenotípusai közötti összefüggéseket kimutatták az általános populációban (Wang, Bafadhel et al. 2016). Mindazonáltal továbbra sem ismert, hogy a PLWHA-k körében miért magasabb a COPD prevalenciája, mint az általános populációban (Drummond, Kunisaki és mtsai, 2016). Jelenleg nem állnak rendelkezésre adatok a szubszaharai afrikai lakosság tüdőmikrobiómáiról, beleértve Ugandát is. Szükség van a tüdő mikrobióma dinamikájának feltárására (Cui, Morris és mtsai 2014, Wang, Bafadhel és mtsai 2016), és azoknak az immunmediált válaszoknak a tisztázására, amelyek felelősek a HIV-fertőzés hátterében a tüdő dysbiosisát követő irreverzibilis tüdőkárosodásért. fertőzés (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). A tüdődysbiosisnak a HIV-vel összefüggő COPD patogenezisében betöltött szerepének megértése rendkívüli jelentőséggel bír az afrikai környezetben, ahol a legmagasabb a HIV/AIDS teher (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Tanulmányi hipotézis

A HIV-fertőzött egyének megváltozott tüdőmikrobióma krónikus obstruktív tüdőbetegséggel (COPD) társul.

Konkrét célok

1. A tüdő mikrobiomának meghatározása HIV-fertőzött és COPD-s nem fertőzött egyének körében (egészséges kontrollok).
2. A tüdő mikrobiomának meghatározása COPD-s HIV-fertőzött egyének körében.
3. A tüdőmikrobiom összehasonlítása HIV-fertőzött COPD-s és HIV-negatív COPD-s egyének között.
4. A tüdő mikrobióma és a COPD közötti összefüggés meghatározása HIV-fertőzött egyénekben.

Problémanyilatkozat

Míg a tüdő mikrobiomáról és a COPD exacerbációiban betöltött szerepéről jelenleg több tanulmány is folyik a nyugati világban (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), korlátozott számban állnak rendelkezésre szakirodalom a HIV szerepéről a COPD patogenezisében (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Még mindig nem ismert, hogy a HIV-fertőzött egyénekben miért alakul ki nagyobb gyakoriságú COPD, mint HIV-negatív társaiknál ​​(Morris, George et al. 2011). Jelenleg nem állnak rendelkezésre adatok a szubszaharai afrikai lakosság tüdőmikrobiómáiról, beleértve Ugandát is. Sürgősen kutatásra van szükség a COPD-ben nem szenvedő egyének tüdőmikrobiómájának leírására és a COPD patogenezisének tisztázására HIV-ben (Morris, George és mtsai 2011, Drummond, Kunisaki és mtsai 2016).

Indokolás

A tüdőmikrobióma és a HIV-vel összefüggő COPD közötti összefüggés megállapítása rendkívül fontos afrikai környezetben, ahol a legmagasabb a HIV/AIDS teher. Az ilyen tanulmányból származó ismeretek iránymutatást nyújtanak a COPD optimális szűrési és kezelési stratégiáinak kialakításában a HIV-populációban.

Mód

Keresztmetszeti vizsgálatot végeznek a Nakaseke-i ART klinikákon részt vevő HIV-fertőzött egyének és a Nakaseke-i tüdőfunkciójú HIV-negatív egyének (LiNK) körében.

Becsült mintanagyság

A hipotézis tesztelésének és teljesítményszámításainak alkalmazása taxonómiai alapú humán mikrobióm adatokra a Human Microbiome project-R (HMP-R) statisztikai csomag (verzió 1.4.3) segítségével, amely Dirichlet-multinomiális modellen[33] működik, a szignifikancia szintre (alfa) beállítva = 5%), résztvevők száma N = 50; szekvencialeolvasások száma ≥20 000 (a minőség-ellenőrzés szempontjából levágásnak tekinthető), teljesítmény ≥99,99% (ez a teljesítmény elegendő a szekvenciaadatokban várhatóan megfigyelhető hatásméret kimutatására). Figyelembe véve a 20%-os kimaradási arányt, az egyes csoportok mintanagysága 63 fő lesz.

Tanulmányi helyszín kiválasztása

A Nakaseke kerületi ART klinikákat a folyamatban lévő COPD/HIV-vizsgálat miatt választották ki a vizsgálat helyszínéül, amelynek célja a HIV-ben a COPD-vel kapcsolatos prevalencia és tényezők meghatározása. Több mint 752 HIV-fertőzött személyt szűrtek COPD-re a standard irányelvek szerint. Ezenkívül a LiNK-vizsgálatot (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) is elvégezték Nakaseke-ben. Ez egy populáció alapú megfigyeléses vizsgálat volt, amely a COPD prevalenciáját, kockázati tényezőit és szimptomatológiáját értékelte Nakaseke vidéki közösségeiben, 1000 35 év feletti személyből és Nakaseke teljes munkaidőben lakóiból álló véletlenszerű rétegzett mintán.

Mintavételi eljárás

Az Epi eszköz véletlenszám-generátor (La Rosa, Brooks et al. 2012) segítségével a vizsgálati személyzet 63 résztvevőt választ ki a célcsoportokból a megfelelő kohorszokból. A kutató asszisztens dokumentálja életkorukat, nemüket és dohányzási történetüket. A COPD+HIV+ csoportot más csoportokból származó résztvevők azonosítására fogják használni.

Tanulási terv

Képzett kutatási asszisztensek és orvosi tiszt a Nakaseke ART klinikákon fog működni. A véletlenszerűen kiválasztott résztvevőkkel telefonon vesszük fel a kapcsolatot. A vizsgálati csoport elmagyarázza a résztvevőknek a protokollt, és ha érdeklődik, a kutatási asszisztens tanulmányi látogatást tervez. A résztvevők tájékozott beleegyezését kérik, és elvégzik az alapvonali spirometriát. A vizsgálatot végző személyzet a köpet indukciós eljárását a szokásos működési eljárásokat követve hajtja végre. Az indukált köpetmintákat köpet-DNS gyűjtő, konzerváló és izoláló készletekkel gyűjtik a gyártó utasításait követve. A tartósítószer komponensei lehetővé teszik, hogy az összegyűjtött mintákat több mint 2 évig tárolják kimutatható DNS-lebomlás nélkül.

Mintakezelés

A mintát a szokásos műveleti eljárások szerint kell kezelni. Röviden, a köpetmintákat egy szivárgásmentes, biológiailag veszélyes zacskóba kell helyezni, lezárt fedéllel és nedvszívó anyaggal. Minden mintát a potenciálisan fertőző anyagok szállítására vonatkozó helyi és nemzeti előírásoknak megfelelően szállítanak.

A mintafeldolgozás központi laboratóriuma

A mintafeldolgozásra a Makerere Egyetem Egészségtudományi Főiskolán, az Orvosi Mikrobiológia épületének 3. emeletén található molekuláris diagnosztikai laboratórium és Integrált Biorepository laboratórium szolgál majd.

Genomiális DNS kivonás

A bakteriális genomiális DNS-t 200 mikroliter köpetmintából vonják ki a kereskedelemben kapható készletek segítségével.

Genomiális DNS-kivonási ellenőrzések

A ZymoBIOMICS Microbial Community Standard pozitív mintakontrollként kerül felhasználásra a DNS-minták elkészítésekor. Negatív kontrollként a DNS Gyűjtőkészletből származó minta nélküli tárolási puffert használjuk.

V3 és V4 hipervariábilis régió polimeráz láncreakció (PCR) amplifikáció

A 16S rRNS gén V3 és V4 hipervariábilis régióját PCR-rel amplifikáljuk kereskedelmi forgalomban kapható primerek felhasználásával.

16S rRNS szekvenálás

A DNS-szekvenálást tételekben, a MiSeq szekvenáló platformot használva, a gyártó protokollja szerint végezzük. Minden tétel a két csoport véletlenszerű mintáiból áll. Egy 1x26-os MiSeq futtatást hajtanak végre a klasztersűrűség és a minták normalizálásának ellenőrzésére. A MiSeq Reporter 2.3-as verziójának Illumina metagenomics munkafolyamatát az indexelt olvasások demultiplexelésére, a szekvenciafájlok generálására és az olvasások osztályozására fogják használni. Szigorú kritériumokat alkalmazunk az alacsony minőségű és kiméra leolvasások eltávolítására.

Statisztikai analízis

Az 1., 2. és 3. konkrét célhoz

1. A klaszteres 16SrRNS-szekvencia beolvasása OTU-kba:

   A minőség-ellenőrzés és az adatok tisztítása után a fennmaradó leolvasásokat egy nyílt referencia-operatív taxonómiai egység (OTU) válogatásnak vetik alá (97%-os azonosságvágás), amelyben az olvasásokat először a Greengenes referenciaszekvenciákhoz csoportosítják. Az OTU-k az összes minta közül a legalacsonyabb olvasási számra lesznek ritkítva, és a ritkított OTU-táblázatot használják az alfa- és béta-diverzitás értékelésére. Az eredmények robusztusságának felmérése érdekében a főkoordináta-elemzést (PCoA) hajtják végre.

2. A tüdő mikrobióma összetétele a célcsoportban a kontrollcsoportokhoz képest:

A vizsgálók kiszámítják az összes azonosított taxonómiai klaszter (OTU) vagy baktériumfaj átlagos százalékos abundanciáját a célpopulációban a kontrollcsoporthoz képest. Ezeket az adatokat a rendszer összefoglalja és hisztogramban mutatja be.

Konkrét cél érdekében 3

1. Többváltozós modellt dolgoznak ki az OTU-k, a klinikai állapot (COPD/HIV) és/vagy a klinikai adatok között. Ezt úgy érjük el, hogy minden folytonos változóra és a bináris eredményre általános lineáris regressziót hajtunk végre. Az OTU-k és a klinikai adatok egy csoportja közötti kapcsolat megállapításához kanonikus korrespondenciaelemzést kell végezni.

   A mikrobiom adatkészlet esetében az összes minta legalább 10%-ában jelen lévő OTU-k bekerülnek az elemzésbe. A klinikai adatkészletben az összes minta több mint 50%-ában hiányzó változókat kizárjuk a hiányzó értékek hatásának minimalizálása érdekében. A kollinearitást a mikrobiom és a klinikai változók páronkénti Pearson-féle korrelációs tesztje segítségével vizsgáljuk. A jelentős modellösszetevőket keresztellenőrzéssel választják ki a SIMCA-P alapértelmezett kritériumaival rendelkező Auto-fit opció használatával (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Az OTU-k, a HIV, a COPD-státusz és a klinikai adatok közötti összefüggés mérése Az egyes OTU-k korrelációjával egyidejű előfordulási hálózat jön létre. A páronkénti Pearson-féle korrelációs tesztet használjuk az együttes előfordulási kapcsolatok szignifikanciájának felmérésére, és csak a szignifikáns korrelációk maradnak meg (korrigált P-érték < 0,05). A False Discovery Rate (FDR) módszert mindvégig használni fogják a P-értékek (adj. P) több teszthez (Wang, Bafadhel et al. 2016). Azok az instabil élek, amelyek pontszámai nem esnek a rendszerindítási eloszlás 95%-os konfidencia intervallumán belülre, eltávolításra kerülnek a hálózatból. A hiányzó értékeket a rendszer kihagyja a korrelációs számításokból. Az OTU hálózat esetében a 100 felső és a 100 legalsó él jelenik meg a végső hálózatban (Wang, Bafadhel et al. 2016).

A tanulmányi korlátok

Ebben a tanulmányban vizsgálataink kiterjednek a tüdőben lévő baktériumközösségekre, amelyeket a kutatók 16SrRNS-szekvenálással azonosítanak. A kutatók elismerik, hogy más mikrobaközösségek (vírusok, gombák és paraziták) szerepet játszhatnak a COPD patogenezisében és exacerbációjában.

Etikai megfontolás

A tanulmányt az Ugandai Nemzeti Tudományos és Technológiai Tanács (UNCST) és a Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC) hagyta jóvá. A résztvevőkkel nem végeznek invazív eljárásokat, és minden szűrés szabványos ellátási megközelítést tartalmaz.

Tájékozott hozzájárulási eljárás:

Titoktartás

A résztvevők egyedi azonosító számokat kapnak az azonosítható adataik helyettesítésére. A résztvevők adataihoz nem csatolunk résztvevőazonosítót. A vizsgálati személyzet hozzáférhet a nyers adatokhoz. Minden adatot jelszóval védett, teljesen titkosított adatbázisban tárolunk, amelyhez csak a vizsgálati személyzet és az elemzésért felelős vizsgálók férhetnek hozzá.