우간다에서 COPD가 있는 HIV 감염자의 폐에서 박테리아 군집 결정. (LMB)

배경

HIV/AID(PLWHA)에 걸린 사람들 사이에서 항레트로바이러스 요법(ART)에 대한 접근성이 향상되면서 HIV 관련 이환율과 사망률이 감소했습니다. 이는 특히 HIV의 부담이 가장 큰 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에서 그러합니다. 사망률 감소로 기대 수명이 크게 증가했으며 PLWHA의 추정치는 이제 일반 인구의 추정치에 근접했습니다(Asiki, Reniers et al. 2016). 결과적으로 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 비전염성 질병(NCD)의 새로운 부담에 대한 생존자들의 관심이 높아졌습니다(Geneau, Stuckler et al. 2010). PLWHA 밀도가 가장 높은 사하라 이남 아프리카는 COPD 관련 이환율과 사망률이 극적으로 증가했습니다(van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). COPD의 병인을 더 자세히 밝히고 최적의 선별 및 치료 전략을 결정하기 위한 연구가 시급히 필요합니다(Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). 폐세균불균형과 COPD 악화 표현형 사이의 연관성은 일반 인구에서 입증되었습니다(Wang, Bafadhel et al. 2016). 그러나 PLWHA가 일반 인구에 비해 COPD 유병률이 더 높은 이유는 아직 알려지지 않았습니다(Drummond, Kunisaki et al. 2016). 현재 우간다를 포함한 일반 사하라 이남 아프리카 인구의 폐 마이크로바이옴에 대한 데이터는 없습니다. 폐 마이크로바이옴의 역학을 탐구하고(Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) HIV 환경에서 폐 불균형에 뒤따를 수 있는 비가역적 폐 손상의 원인이 되는 면역 매개 반응을 밝힐 필요가 있습니다. 감염(Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). HIV 관련 COPD의 병인에서 폐 세균불균형의 역할을 이해하는 것은 HIV/AID 부담이 가장 높은 아프리카 환경에서 가장 중요합니다(Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

연구 가설

HIV에 감염된 개인의 변경된 폐 마이크로바이옴은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 관련이 있습니다.

구체적인 목표

1. COPD(건강한 대조군)가 없는 HIV 감염 및 감염되지 않은 개인 사이에서 폐 마이크로바이옴을 결정합니다.
2. COPD가 있는 HIV 감염자 사이에서 폐 마이크로바이옴을 결정합니다.
3. COPD가 있는 HIV 감염자와 COPD가 있는 HIV 음성 개인 사이의 폐 마이크로바이옴을 비교합니다.
4. HIV에 감염된 개체에서 폐 마이크로바이옴과 COPD 사이의 연관성을 결정합니다.

문제 설명

폐 마이크로바이옴과 COPD 악화에서의 역할에 대한 여러 연구가 현재 서구 세계에서 수행되고 있는 반면(Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), 제한적입니다. COPD 병인에서 HIV의 역할에 관한 문헌(Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). HIV에 감염된 개인이 HIV 음성 대응자보다 더 높은 유병률로 COPD를 발병하는 이유는 아직 알려지지 않았습니다(Morris, George et al. 2011). 현재 우간다를 포함한 일반 사하라 이남 아프리카 인구의 폐 마이크로바이옴에 대한 데이터는 없습니다. COPD가 없는 개인의 폐 마이크로바이옴을 설명하고 HIV에서 COPD의 병인을 밝히기 위한 연구가 시급히 필요합니다(Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

정당화

폐 마이크로바이옴과 HIV 관련 COPD 사이의 연관성을 확립하는 것은 HIV/AID 부담이 가장 높은 아프리카 환경에서 가장 중요합니다. 이러한 연구에서 얻은 지식은 HIV 인구에서 COPD의 최적 선별 및 치료 전략 개발을 안내할 것입니다.

행동 양식

Nakaseke의 ART 클리닉에 다니는 HIV 감염자와 Nakaseke(LiNK) 연구의 폐 기능에서 HIV 음성인 사람들 사이에서 단면 연구를 수행할 것입니다.

예상 샘플 크기

Dirichlet-다항 모델[33]에서 작동하는 Human Microbiome project-R(HMP-R) 통계 패키지(버전 1.4.3)를 사용하여 분류학적 기반 인간 마이크로바이옴 데이터에 대한 가설 검정 및 검정력 계산 적용, 유의 수준(알파 = 5%로 설정), 참가자 수 N = 50; 시퀀스 판독 수 ≥20,000(품질 관리를 위한 컷오프로 간주됨), 파워 ≥99.99%(이 파워는 시퀀스 데이터에서 관찰될 것으로 예상되는 효과 크기를 감지하기에 충분함). 20%의 불참율을 고려하면 각 그룹의 표본 크기는 63명이 될 것입니다.

연구 사이트 선택

Nakaseke 지구 ART 클리닉은 HIV에서 COPD와 관련된 유병률 및 요인을 결정하는 것이 목표인 진행 중인 COPD/HIV 연구 때문에 연구 장소로 선택되었습니다. 752명 이상의 HIV 감염자가 표준 지침에 따라 COPD 검사를 받았습니다. 또한, LiNK 연구(Nakaseke 및 Kampala(LiNK)의 폐 기능, PI: Kirenga, Checkley)도 Nakaseke에서 수행되었습니다. 나카세케에 거주하는 35세 이상 개인 1000명의 계층화된 무작위 표본을 사용하여 나카세케의 시골 지역사회에서 COPD 유병률, 위험 요인 및 증상을 평가하는 인구 기반 관찰 연구였습니다.

샘플링 절차

Epi 도구 난수 생성기(La Rosa, Brooks et al. 2012)를 사용하여 연구 직원은 각 코호트에서 대상 그룹의 63명의 참가자를 선택합니다. 연구 조교는 연령, 성별 및 흡연 기록을 문서화합니다. COPD+HIV+ 그룹은 다른 그룹의 참가자를 식별하는 데 사용됩니다.

공부 계획

훈련된 연구 보조원과 의료진은 Nakaseke ART 클리닉에 기반을 둘 것입니다. 무작위로 선정된 참가자에게는 전화로 연락을 드립니다. 연구 팀은 참가자들에게 프로토콜을 설명하고 관심이 있는 경우 연구 보조원이 연구 방문 일정을 잡을 것입니다. 그들은 참가자로부터 정보에 입각한 동의를 얻고 기준 폐활량 측정이 수행됩니다. 연구 직원은 표준 운영 절차에 따라 가래 유도 절차를 수행합니다. 유도된 객담 표본은 제조업체의 지침에 따라 객담 DNA 수집, 보존 및 격리 키트를 사용하여 수집됩니다. 보존제의 구성 요소는 수집된 샘플을 감지할 수 있는 DNA 분해 없이 2년 이상 보관할 수 있게 합니다.

시편 취급

표본은 표준 운영 절차에 따라 처리됩니다. 간단히 말해서, 객담 표본은 밀폐된 뚜껑과 흡수재가 있는 누출 방지 생물학적 위험 백에 넣습니다. 모든 검체는 감염 가능성이 있는 물질의 운송에 관한 지역 및 국가 규정에 따라 운송됩니다.

시료 처리를 위한 핵심 실험실

Medical Microbiology 건물 3층에 있는 Makerere University College of Health Sciences에 위치한 분자진단 실험실과 Integrated Biorepository 실험실은 샘플 처리를 위해 사용될 것입니다.

게놈 DNA 추출

박테리아 게놈 DNA는 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 가래 샘플 200마이크로리터에서 추출됩니다.

게놈 DNA 추출 컨트롤

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard는 DNA 샘플을 준비할 때 양성 샘플 컨트롤로 사용됩니다. 샘플이 추가되지 않은 DNA 수집 키트의 보관 버퍼가 음성 대조군으로 사용됩니다.

V3 및 V4 초가변 영역 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭

16S rRNA 유전자의 V3 및 V4 초가변 영역은 시판되는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭됩니다.

16S rRNA 시퀀싱

DNA 시퀀싱은 제조업체의 프로토콜에 따라 MiSeq 시퀀싱 플랫폼을 활용하여 배치로 수행됩니다. 각 배치는 두 그룹의 무작위 샘플로 구성됩니다. 클러스터 밀도 및 샘플 정규화를 확인하기 위해 1x26 MiSeq 실행이 수행됩니다. MiSeq Reporter 버전 2.3의 Illumina metagenomics 워크플로는 색인화된 읽기 역다중화, 시퀀스 파일 생성 및 읽기 분류에 사용됩니다. 낮은 품질 및 키메라 읽기를 제거하기 위해 엄격한 기준이 사용됩니다.

통계 분석

특정 목표 1, 2 및 3

1. 16SrRNA 시퀀스 읽기를 OTU로 클러스터링:

   품질 관리 및 데이터 정리 후 나머지 읽기는 Greengenes 참조 시퀀스에 대해 읽기가 먼저 클러스터링되는 공개 참조 운영 분류 단위(OTU) 피킹(97% 동일성 컷오프)의 대상이 됩니다. OTU는 모든 샘플 중에서 가장 낮은 읽기 수로 희박해지고 희박한 OTU 테이블은 알파 및 베타 다양성을 평가하는 데 사용됩니다. Jack-knifing Principal Coordinate Analysis(PCoA)는 결과의 견고성을 평가하기 위해 수행됩니다.

2. 대조군과 비교하여 표적에서 폐 마이크로바이옴의 구성:

조사관은 식별된 모든 분류학적 클러스터(OTU) 또는 대상 집단 대 대조군의 박테리아 종의 평균 백분율 풍부도를 계산합니다. 이 데이터는 요약되어 히스토그램으로 표시됩니다.

특정 목적을 위해 3

1. OTU, 임상 상태(COPD/HIV) 및/또는 임상 데이터 간의 다변량 모델이 개발됩니다. 이는 각 연속 변수 및 이진 결과에 대해 일반 선형 회귀를 수행하여 달성됩니다. OTU와 임상 데이터 그룹 간의 관계를 설정하기 위해 정준 대응 분석이 수행됩니다.

   마이크로바이옴 데이터 세트의 경우 모든 샘플의 최소 10%에 존재할 OTU가 분석에 포함됩니다. 임상 데이터 세트의 경우 모든 샘플의 50% 이상에서 누락될 변수는 누락된 값의 영향을 최소화하기 위해 제외됩니다. 공선성은 미생물 및 임상 변수에 대한 Pearson의 쌍별 상관 테스트를 사용하여 해결됩니다. 중요한 모델 구성 요소는 SIMCA-P(Wang, Bafadhel et al. 2016)의 기본 기준으로 자동 맞춤 옵션을 사용하여 교차 검증을 통해 선택됩니다.

2. OTU, HIV, COPD 상태 및 임상 데이터 간의 연관성 측정 동시 발생 네트워크는 개별 OTU의 상관 관계에 의해 설정됩니다. 동시 발생 관계의 중요성을 평가하기 위해 Pairwise Pearson의 상관관계 검정을 사용하고 유의한 상관관계만 유지합니다(조정된 P-값 < 0.05). FDR(False Discovery Rate) 방법은 P-값(adj. P) 다중 테스트용(Wang, Bafadhel et al. 2016). 점수가 부트스트랩 분포의 95% 신뢰 구간 내에 있지 않은 불안정한 에지는 네트워크에서 제거됩니다. 누락된 값은 상관 관계 계산에서 생략됩니다. OTU 네트워크의 경우 100개의 최상위 에지와 100개의 최하위 에지가 최종 네트워크에 표시됩니다(Wang, Bafadhel et al. 2016).

연구 제한

이 연구에서 우리 조사의 범위는 조사관이 16SrRNA 시퀀싱으로 식별할 폐의 박테리아 군집을 포함할 것입니다. 연구자들은 다른 미생물 군집(바이러스, 곰팡이 및 기생충)이 COPD 병인 및 악화에 역할을 할 수 있음을 인정합니다.

윤리적 배려

이 연구는 우간다 과학 기술 위원회(UNCST)와 물라고 병원 연구 윤리 위원회(MHREC)의 승인을 받았습니다. 참가자에게 침습적 절차가 수행되지 않으며 모든 선별 검사에는 표준 현장 진료 접근 방식이 포함됩니다.

정보에 입각한 동의 절차:

기밀성

참가자에게는 식별 가능한 데이터를 대체할 고유 식별 번호가 부여됩니다. 참가자 데이터에는 참가자 식별자가 첨부되지 않습니다. 연구 직원은 원시 데이터에 액세스할 수 있습니다. 모든 데이터는 암호로 보호되고 완전히 암호화된 데이터베이스에 저장되며 분석을 담당하는 연구 직원과 조사관만 액세스할 수 있습니다.