Bestämning av bakteriesamhällen i lungorna hos HIV-infekterade individer med KOL i Uganda. (LMB)

Bakgrund

Förbättringarna i tillgången till antiretroviral terapi (ART) bland personer som lever med HIV/AIDs (PLWHA) har resulterat i en minskning av HIV-associerad sjuklighet och dödlighet. Detta gäller särskilt i låg- och medelinkomstländer (LMICs), som bär den största bördan av hiv. Minskningen av dödligheten har ökat den förväntade livslängden avsevärt, med uppskattningar bland PLWHA som nu närmar sig den för den allmänna befolkningen (Asiki, Reniers et al. 2016). Följaktligen har det blivit ökad uppmärksamhet bland överlevande för den framväxande bördan av icke-smittsamma sjukdomar (NCD), såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) (Geneau, Stuckler et al. 2010). Afrika söder om Sahara, som har den högsta tätheten av PLWHA, har upplevt dramatiska ökningar av KOL-relaterad sjuklighet och dödlighet (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Studier behövs omgående för att ytterligare belysa patogenesen av KOL, och för att fastställa optimala screening- och behandlingsstrategier (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Samband mellan lungdysbios och KOL-exacerbationsfenotyper har visats i den allmänna befolkningen (Wang, Bafadhel et al. 2016). Det är dock fortfarande okänt varför PLWHA har högre prevalens av KOL jämfört med den allmänna befolkningen (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Inga data finns för närvarande om lungmikrobiom i den allmänna afrikanska befolkningen söder om Sahara, inklusive Uganda. Det finns ett behov av att utforska dynamiken i lungmikrobiomet (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) och belysa immunförmedlade svar som är ansvariga för irreversibel lungskada som kan följa lungdysbios i miljön med HIV infektion (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Att förstå rollen av lungdysbios i patogenesen av HIV-associerad KOL är av yttersta betydelse i den afrikanska miljön med den högsta HIV/AID-bördan (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Studera hypotesen

Förändrat lungmikrobiom hos HIV-infekterade individer är associerat med kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL).

Specifika mål

1. Att bestämma lungmikrobiomet bland HIV-infekterade och oinfekterade individer utan KOL (friska kontroller).
2. Att bestämma lungmikrobiomet bland HIV-infekterade individer med KOL.
3. Att jämföra lungmikrobiom bland HIV-infekterade individer med KOL och HIV-negativa individer med KOL.
4. Att bestämma sambandet mellan lungmikrobiom och KOL hos HIV-infekterade individer.

Problembeskrivning

Medan flera studier av lungmikrobiom och dess roll i KOL-exacerbationer för närvarande genomförs i västvärlden (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), finns det begränsat litteratur om HIVs roll i KOL-patogenes (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Det är fortfarande okänt varför hiv-infekterade individer utvecklar KOL med en högre prevalens än sina hiv-negativa motsvarigheter (Morris, George et al. 2011). Inga data finns för närvarande om lungmikrobiom i den allmänna afrikanska befolkningen söder om Sahara, inklusive Uganda. Forskning behövs akut för att beskriva lungmikrobiomet hos individer utan KOL och för att belysa patogenesen av KOL vid HIV (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Berättigande

Att etablera ett samband mellan lungmikrobiom och HIV-associerad KOL är av yttersta betydelse i den afrikanska miljön med den högsta HIV/AID-bördan. Kunskapen från en sådan studie kommer att vägleda utvecklingen av optimala screening- och behandlingsstrategier för KOL i HIV-populationen.

Metoder

En tvärsnittsstudie kommer att genomföras bland HIV-infekterade individer som går på ART-kliniker i Nakaseke och HIV-negativa individer från lungfunktion i Nakaseke (LiNK) studie.

Beräknad provstorlek

Tillämpning av hypotestestning och effektberäkningar för taxonomisk baserad human mikrobiomdata med hjälp av det statistiska paketet Human Microbiome project-R (HMP-R) (version1.4.3) som arbetar på Dirichlet-multinommodellen[33], För signifikansnivå (alfa) satt till = 5 %), antal deltagare N = 50; antal sekvensavläsningar ≥20 000 (anses som avstängd för kvalitetskontroll), effekt ≥99,99 % (denna effekt är tillräcklig för att detektera effektstorleken som förväntas observeras i sekvensdata). Med tanke på 20 % icke-deltagande kommer urvalsstorleken för varje grupp att vara 63 deltagare.

Val av studieplats

Nakaseke distriktets ART-kliniker har valts ut som studieplatser på grund av den pågående KOL/HIV-studien vars mål är att fastställa prevalensen och faktorerna associerade med KOL i HIV. Över 752 HIV-infekterade individer har screenats för KOL enligt standardriktlinjer. Dessutom genomfördes LiNK-studien (Lungfunktion i Nakaseke och Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) i Nakaseke. Det var en befolkningsbaserad observationsstudie som utvärderade KOL-prevalens, riskfaktorer och symptomatologi i landsbygdssamhällen i Nakaseke med ett stratifierat slumpmässigt urval av 1000 individer över 35 år och heltidsinvånare i Nakaseke.

Provtagningsförfarande

Med hjälp av Epi-verktyget slumptalsgenerator (La Rosa, Brooks et al. 2012) kommer studiepersonalen att välja ut 63 deltagare i målgrupperna från våra respektive kohorter. Forskningsassistenten kommer att dokumentera sin ålder, kön och rökhistoria. KOL+HIV+-gruppen kommer att användas för att identifiera deltagare från andra grupper.

Studieplan

Utbildade forskningsassistenter och en läkare kommer att vara baserade på Nakaseke ART-kliniker. Slumpmässigt utvalda deltagare kommer att kontaktas per telefon. Studiegruppen kommer att förklara protokollet för deltagarna och vid intresse kommer ett studiebesök att planeras av forskningsassistenten. De kommer att få informerat samtycke från deltagarna och en baslinjespirometri kommer att göras. Studiepersonalen kommer att utföra sputuminduktionsprocedur enligt standardförfaranden. Inducerade sputumprover kommer att samlas in med hjälp av sputum-DNA-uppsamlings-, konserverings- och isoleringssatser enligt tillverkarens instruktioner. Konserveringsmedlets komponenter gör att de insamlade proverna kan lagras i mer än 2 år utan någon detekterbar DNA-nedbrytning.

Provhantering

Prover kommer att hanteras enligt standardprocedurerna. Kortfattat kommer sputumprover att placeras i en läckagesäker biofarlig påse med förseglade lock och absorberande material. Alla prover kommer att transporteras i enlighet med lokala och nationella bestämmelser som reglerar transport av potentiellt smittsamt material.

Kärnlaboratorium för provbearbetning

Molekylärt diagnostiklaboratorium och Integrated Biorepository-laboratorium beläget vid Makerere University College of Health Sciences på 3:e våningen i Medical Microbiology-byggnaden kommer att användas för provbearbetning.

Genomisk DNA-extraktion

Bakteriellt genomiskt DNA kommer att extraheras från 200 mikroliter sputumprover med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.

Genomiska DNA-extraktionskontroller

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard kommer att användas som en positiv provkontroll vid beredning av DNA-prov. Förvaringsbuffert från DNA Collection Kit utan tillsatt prov kommer att användas som negativ kontroll.

V3 och V4 hypervariabel region polymeraskedjereaktion (PCR) amplifiering

Den hypervariabla V3- och V4-regionen av 16S rRNA-genen kommer att PCR-amplifieras med användning av kommersiellt tillgängliga primrar.

16S rRNA-sekvensering

DNA-sekvensering kommer att göras i batcher med MiSeq-sekvenseringsplattform enligt tillverkarens protokoll. Varje parti kommer att bestå av randomiserade prover från de två grupperna. En 1x26 MiSeq-körning kommer att utföras för att kontrollera klusterdensitet och normalisering av prover. Illumina metagenomics arbetsflöde av MiSeq Reporter version 2.3 kommer att användas för demultiplexering av indexerade läsningar, generering av sekvensfiler och klassificering av läsningar. Stringenta kriterier kommer att användas för att ta bort lågkvalitativa och chimära läsningar.

Statistisk analys

För specifika mål 1, 2 och 3

1. Klustring av 16SrRNA-sekvens läses in i OTU:er:

   Efter kvalitetskontroll och datarensning kommer de återstående läsningarna att utsättas för en öppen referensoperationell taxonomisk enhet (OTU) plockning (97 % identitetsgräns) där läsningarna först kommer att klustras mot Greengenes referenssekvenser. OTU:er försämras till det lägsta antalet avläsningar av alla prover, och den försämrade OTU-tabellen kommer att användas för att bedöma alfa- och betadiversitet. En jack-knifing Principal Coordinate Analysis (PCoA) kommer att utföras för att bedöma resultatens robusthet.

2. Sammansättning av lungmikrobiomet i målet jämfört med kontrollgrupper:

Utredarna kommer att beräkna den genomsnittliga procentuella förekomsten av alla identifierade taxonomiska kluster OTU) eller bakteriearter i målpopulationen kontra kontrollgruppen. Dessa data kommer att sammanfattas och presenteras i histogram.

För specifikt syfte 3

1. En multivariat modell mellan OTU, klinisk status (KOL/HIV) och/eller kliniska data kommer att utvecklas. Detta kommer att uppnås genom att utföra en generell linjär regression för varje kontinuerlig variabel och det binära utfallet. För att fastställa sambandet mellan OTU:er och en grupp av kliniska data kommer en kanonisk korrespondensanalys att utföras.

   För mikrobiomdatauppsättningen kommer OTU:er som kommer att finnas i minst 10 % av alla prover att inkluderas i analysen. För den kliniska datamängden kommer variabler som kommer att saknas i mer än 50 % av alla prover att exkluderas för att minimera effekterna av saknade värden. Kollinearitet kommer att behandlas med hjälp av parvisa Pearsons korrelationstest på mikrobiom och kliniska variabler. Betydande modellkomponenter kommer att väljas genom korsvalidering med hjälp av alternativet Auto-fit med standardkriterier i SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Mätning av samband mellan OTU, HIV, KOL-status och kliniska data. Ett nätverk för samtidig förekomst kommer att upprättas genom korrelation av individuella OTU. Parvis Pearsons korrelationstest kommer att användas för att bedöma signifikansen av samförekomstsamband, och endast signifikanta korrelationer kommer att behållas (justerat P-värde < 0,05). Metoden False Discovery Rate (FDR) kommer att användas genomgående för att justera P-värden (adj. P) för flera tester (Wang, Bafadhel et al. 2016). Instabila kanter vars poäng inte kommer att ligga inom 95 % konfidensintervall för bootstrapdistribution kommer att tas bort från nätverket. Saknade värden kommer att utelämnas från korrelationsberäkningar. För OTU-nätverket kommer de 100 topprankade och 100 bottenrankade kanterna att visas i det slutliga nätverket (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Studiebegränsningar

I denna studie kommer omfattningen av våra undersökningar att involvera bakteriesamhällen i lungorna som utredarna kommer att identifiera genom 16SrRNA-sekvensering. Utredarna erkänner att andra mikrobsamhällen (virala, svampar och parasiter) kan spela en roll i KOL-patogenes och exacerbation.

Etiskt övervägande

Studien godkändes av Uganda National Council of Science and Technology (UNCST) och Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC). Inga invasiva procedurer görs för deltagarna och all screening kommer att omfatta standardmetoder för vård.

Processen för informerat samtycke:

Sekretess

Deltagarna kommer att få unika identifikationsnummer för att ersätta deras identifierbara data. Inga deltagaridentifierare kommer att bifogas deltagardata. Studiepersonal kommer att ha tillgång till rådata. All data kommer att lagras i en lösenordsskyddad, helt krypterad databas, endast tillgänglig för studiepersonalen och utredarna som ansvarar för analysen.