Détermination des communautés bactériennes dans les poumons des personnes infectées par le VIH atteintes de MPOC en Ouganda. (LMB)

Arrière-plan

L'amélioration de l'accès à la thérapie antirétrovirale (TAR) chez les personnes vivant avec le VIH/SIDA (PVVIH) a entraîné une diminution de la morbidité et de la mortalité associées au VIH. Cela est particulièrement vrai dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI), qui supportent le plus lourd fardeau du VIH. La réduction de la mortalité a considérablement augmenté l'espérance de vie, les estimations parmi les PVVIH se rapprochant désormais de celles de la population générale (Asiki, Reniers et al. 2016). Par conséquent, les survivants ont accordé une attention accrue au fardeau émergent des maladies non transmissibles (MNT), telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) (Geneau, Stuckler et al. 2010). L'Afrique subsaharienne, qui a la plus forte densité de PVVIH, a connu des augmentations spectaculaires de la morbidité et de la mortalité liées à la MPOC (van Zyl Smit, Pai et al. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Des études sont nécessaires de toute urgence pour élucider davantage la pathogenèse de la MPOC et pour déterminer les stratégies optimales de dépistage et de traitement (Asiki, Reniers et al. 2016, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Des associations entre la dysbiose pulmonaire et les phénotypes d'exacerbation de la BPCO ont été démontrées dans la population générale (Wang, Bafadhel et al. 2016). Cependant, on ne sait toujours pas pourquoi les PVVIH ont une prévalence plus élevée de BPCO par rapport à la population générale (Drummond, Kunisaki et al. 2016). Aucune donnée n'existe actuellement sur le microbiome pulmonaire dans la population générale d'Afrique subsaharienne, y compris l'Ouganda. Il est nécessaire d'explorer la dynamique du microbiome pulmonaire (Cui, Morris et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) et d'élucider les réponses à médiation immunitaire responsables des lésions pulmonaires irréversibles pouvant suivre une dysbiose pulmonaire dans le cadre du VIH. (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016). Comprendre le rôle de la dysbiose pulmonaire dans la pathogenèse de la BPCO associée au VIH est de la plus haute importance dans le contexte africain où le fardeau du VIH/SIDA est le plus élevé (Cassol, Cassetta et al. 2010, Morris, George et al. 2011).

Hypothèse de l'étude

Le microbiome pulmonaire altéré chez les personnes infectées par le VIH est associé à la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC).

Objectifs spécifiques

1. Déterminer le microbiome pulmonaire chez les personnes infectées et non infectées par le VIH sans MPOC (témoins sains).
2. Déterminer le microbiome pulmonaire chez les personnes infectées par le VIH atteintes de MPOC.
3. Comparer le microbiome pulmonaire chez les personnes infectées par le VIH atteintes de MPOC et les personnes séronégatives atteintes de MPOC.
4. Déterminer l'association entre le microbiome pulmonaire et la MPOC chez les personnes infectées par le VIH.

Énoncé du problème

Alors que de multiples études sur le microbiome pulmonaire et son rôle dans les exacerbations de la MPOC sont actuellement menées dans le monde occidental (Cui, Morris et al. 2014, Sze, Hogg et al. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) , il existe peu littérature sur le rôle du VIH dans la pathogenèse de la MPOC (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). On ne sait toujours pas pourquoi les personnes infectées par le VIH développent une MPOC avec une prévalence plus élevée que leurs homologues séronégatifs (Morris, George et al. 2011). Aucune donnée n'existe actuellement sur le microbiome pulmonaire dans la population générale d'Afrique subsaharienne, y compris l'Ouganda. Des recherches sont nécessaires de toute urgence pour décrire le microbiome pulmonaire chez les personnes sans MPOC et pour élucider la pathogenèse de la MPOC dans le VIH (Morris, George et al. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016).

Justification

L'établissement d'une association entre le microbiome pulmonaire et la BPCO associée au VIH est de la plus haute importance dans le contexte africain où le fardeau du VIH/SIDA est le plus élevé. Les connaissances issues d'une telle étude guideront le développement de stratégies optimales de dépistage et de traitement de la BPCO dans la population séropositive.

Méthodes

Une étude transversale sera menée auprès des personnes infectées par le VIH fréquentant les cliniques de TAR à Nakaseke et des personnes séronégatives de l'étude sur la fonction pulmonaire à Nakaseke (LiNK).

Taille estimée de l'échantillon

En appliquant les tests d'hypothèses et les calculs de puissance pour les données taxonomiques du microbiome humain à l'aide du progiciel statistique Human Microbiome project-R (HMP-R) (version 1.4.3) qui fonctionne sur le modèle Dirichlet-multinomial [33], pour le niveau de signification (alpha fixé à = 5 %), nombre de participants N = 50 ; nombre de lectures de séquence ≥ 20 000 (considérées comme seuil pour le contrôle qualité), puissance ≥ 99,99 % (cette puissance est suffisante pour détecter la taille de l'effet qui devrait être observée dans les données de séquence). Compte tenu d'un taux de non-participation de 20 %, la taille de l'échantillon pour chaque groupe sera de 63 participants.

Sélection du site d'étude

Les cliniques de TAR du district de Nakaseke ont été choisies comme sites d'étude en raison de l'étude MPOC/VIH en cours dont les objectifs sont de déterminer la prévalence et les facteurs associés à la MPOC dans le VIH. Plus de 752 personnes infectées par le VIH ont été dépistées pour la MPOC conformément aux directives standard. De plus, l'étude LiNK (Lung Function in Nakaseke and Kampala (LiNK), PI : Kirenga, Checkley) a également été menée à Nakaseke. Il s'agissait d'une étude observationnelle basée sur la population évaluant la prévalence de la MPOC, les facteurs de risque et la symptomatologie dans les communautés rurales de Nakaseke à l'aide d'un échantillon aléatoire stratifié de 1000 personnes âgées de plus de 35 ans et résidant à temps plein à Nakaseke.

Procédure d'échantillonnage

À l'aide du générateur de nombres aléatoires de l'outil Epi (La Rosa, Brooks et al. 2012), le personnel de l'étude sélectionnera 63 participants dans les groupes cibles de nos cohortes respectives. L'assistant de recherche documentera leur âge, leur sexe et leurs antécédents de tabagisme. Le groupe MPOC+VIH+ sera utilisé pour identifier les participants d'autres groupes.

Plan d'étude

Des assistants de recherche formés et un médecin seront basés dans les cliniques Nakaseke ART. Les participants sélectionnés au hasard seront contactés par téléphone. L'équipe d'étude expliquera le protocole aux participants et si intéressé, une visite d'étude sera programmée par l'assistant de recherche. Ils obtiendront le consentement éclairé des participants et une spirométrie de référence sera effectuée. Le personnel de l'étude effectuera la procédure d'induction de l'expectoration en suivant les procédures opératoires standard. Les échantillons d'expectorations induites seront prélevés à l'aide de kits de collecte, de conservation et d'isolement d'ADN d'expectoration conformément aux instructions du fabricant. Les composants du conservateur permettront de conserver les échantillons collectés pendant plus de 2 ans sans aucune dégradation détectable de l'ADN.

Manipulation des échantillons

Les spécimens seront manipulés conformément aux procédures opérationnelles standard. En bref, les échantillons d'expectoration seront placés dans un sac anti-fuites pour risques biologiques avec des couvercles scellés et un matériau absorbant. Tous les échantillons seront transportés conformément aux réglementations locales et nationales régissant le transport de matériel potentiellement infectieux.

Laboratoire principal pour le traitement des échantillons

Le laboratoire de diagnostic moléculaire et le laboratoire de bioréserve intégré situés au Makerere University College of Health Sciences au 3e étage du bâtiment de microbiologie médicale seront utilisés pour le traitement des échantillons.

Extraction d'ADN génomique

L'ADN génomique bactérien sera extrait de 200 microlitres d'échantillons d'expectorations à l'aide de kits disponibles dans le commerce.

Contrôles d'extraction d'ADN génomique

ZymoBIOMICS Microbial Community Standard sera utilisé comme échantillon de contrôle positif lors de la préparation des échantillons d'ADN. Le tampon de stockage du kit de prélèvement d'ADN sans échantillon ajouté sera utilisé comme contrôle négatif.

Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) des régions hypervariables V3 et V4

La région hypervariable V3 et V4 du gène de l'ARNr 16S sera amplifiée par PCR en utilisant des amorces disponibles dans le commerce.

Séquençage de l'ARNr 16S

Le séquençage de l'ADN sera effectué par lots à l'aide de la plate-forme de séquençage MiSeq conformément au protocole du fabricant. Chaque lot sera composé d'échantillons randomisés des deux groupes. Une analyse MiSeq 1x26 sera effectuée pour vérifier la densité des grappes et la normalisation des échantillons. Le flux de travail de métagénomique Illumina par MiSeq Reporter version 2.3 sera utilisé pour démultiplexer les lectures indexées, générer des fichiers de séquence et classer les lectures. Des critères rigoureux seront utilisés pour supprimer les lectures de mauvaise qualité et chimériques.

analyses statistiques

Pour les objectifs spécifiques 1, 2 et 3

1. La séquence de clustering 16SrRNA se lit dans les OTU :

   Après le contrôle de la qualité et le nettoyage des données, les lectures restantes seront soumises à une sélection d'unité taxonomique opérationnelle (OTU) de référence ouverte (seuil d'identité de 97 %) dans laquelle les lectures seront d'abord regroupées contre les séquences de référence Greengenes. Les OTU seront raréfiées au plus petit nombre de lectures parmi tous les échantillons, et la table OTU raréfiée sera utilisée pour évaluer la diversité alpha et bêta . Une analyse en coordonnées principales (PCoA) jack-knifing sera effectuée pour évaluer la robustesse des résultats.

2. Composition du microbiome pulmonaire dans la cible par rapport aux groupes témoins :

Les enquêteurs calculeront le pourcentage moyen d'abondance de tous les groupes taxonomiques identifiés OTU) ou espèces bactériennes dans la population cible par rapport au groupe témoin. Ces données seront résumées et présentées sous forme d'histogramme.

Pour l'objectif spécifique 3

1. Un modèle multivarié entre UTO, statut clinique (BPCO/VIH) et/ou données cliniques sera développé. Ceci sera réalisé en effectuant une régression linéaire générale pour chaque variable continue et le résultat binaire. Pour établir la relation entre les UTO et un groupe de données cliniques, une analyse canonique des correspondances sera effectuée.

   Pour l'ensemble de données sur le microbiome, les OTU qui seront présentes dans au moins 10 % de tous les échantillons seront incluses dans l'analyse. Pour l'ensemble de données cliniques, les variables manquantes dans plus de 50 % de tous les échantillons seront exclues afin de minimiser les effets des valeurs manquantes. La colinéarité sera abordée à l'aide du test de corrélation de Pearson par paires sur le microbiome et les variables cliniques. Les composants significatifs du modèle seront sélectionnés par validation croisée à l'aide de l'option d'ajustement automatique avec des critères par défaut dans le SIMCA-P (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. Mesurer l'association entre les OTU, le VIH, le statut BPCO et les données cliniques Un réseau de cooccurrence sera établi par corrélation des OTU individuelles. Le test de corrélation de Pairwise Pearson sera utilisé pour évaluer l'importance des relations de cooccurrence, et seules les corrélations significatives seront retenues (valeur P ajustée < 0,05). La méthode False Discovery Rate (FDR) sera utilisée tout au long pour ajuster les valeurs P (adj. P) pour plusieurs tests (Wang, Bafadhel et al. 2016). Les tronçons instables dont les scores ne seront pas dans l'intervalle de confiance de 95 % de la distribution bootstrap seront supprimés du réseau. Les valeurs manquantes seront omises des calculs de corrélation. Pour le réseau OTU, les 100 bords de premier rang et les 100 bords de rang inférieur seront affichés dans le réseau final (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Limites de l'étude

Dans cette étude, la portée de nos investigations impliquera des communautés bactériennes dans les poumons que les chercheurs identifieront par séquençage de 16SrRNA. Les chercheurs reconnaissent que d'autres communautés microbiennes (virales, fongiques et parasites) peuvent jouer un rôle dans la pathogenèse et l'exacerbation de la MPOC.

Considération éthique

L'étude a été approuvée par le Conseil national ougandais de la science et de la technologie (UNCST) et le Comité d'éthique de la recherche de l'hôpital de Mulago (MHREC). Aucune procédure invasive n'est pratiquée sur les participants et tous les dépistages incluront des approches standard au point de service.

Processus de consentement éclairé :

Confidentialité

Les participants recevront des numéros d'identification uniques pour remplacer leurs données identifiables. Aucun identifiant de participant ne sera joint aux données des participants. Le personnel de l'étude aura accès aux données brutes. Toutes les données seront stockées dans une base de données entièrement cryptée et protégée par un mot de passe, accessible uniquement au personnel de l'étude et aux enquêteurs responsables de l'analyse.