Bakteeriyhteisöjen määrittäminen keuhkoahtaumatautia sairastavien HIV-tartunnan saaneiden yksilöiden keuhkoissa Ugandassa. (LMB)

Tausta

Antiretroviraalisen hoidon (ART) saatavuuden paraneminen HIV/AIDS:ää (PLWHA) sairastavien ihmisten keskuudessa on johtanut HIV:hen liittyvän sairastuvuuden ja kuolleisuuden vähenemiseen. Tämä pätee erityisesti matalan ja keskitulotason maissa (LMIC), jotka kantavat suurimman HIV-taakan. Kuolleisuuden väheneminen on pidentänyt merkittävästi elinajanodotetta, ja arviot PLWHA:ista lähestyvät nyt väestön arviota (Asiki, Reniers et al. 2016). Tästä johtuen eloonjääneiden keskuudessa on kiinnitetty entistä enemmän huomiota ei-tarttuvien sairauksien (NCD), kuten kroonisen obstruktiivisen keuhkosairauden (COPD) lisääntymiseen (Geneau, Stuckler et al. 2010). Saharan eteläpuolisessa Afrikassa, jossa PLWHA:ita on eniten, keuhkoahtaumatautiin liittyvä sairastuvuus ja kuolleisuus on lisääntynyt dramaattisesti (van Zyl Smit, Pai ym. 2010, Asiki, Reniers et al. 2016). Tutkimuksia tarvitaan kiireesti keuhkoahtaumatautien patogeneesin selvittämiseksi ja optimaalisten seulonta- ja hoitostrategioiden määrittämiseksi (Asiki, Reniers ym. 2016, Drummond, Kunisaki ym. 2016). Keuhkodysbioosin ja keuhkoahtaumatautien pahenemisfenotyyppien väliset yhteydet on osoitettu väestössä (Wang, Bafadhel et al. 2016). Edelleen on kuitenkin epäselvää, miksi PLWHA-potilailla on yleisempi keuhkoahtaumatauti verrattuna väestöön (Drummond, Kunisaki ym. 2016). Tällä hetkellä ei ole tietoa keuhkojen mikrobiomista Saharan eteläpuolisen Afrikan yleisessä väestössä, mukaan lukien Ugandassa. On tarpeen tutkia keuhkojen mikrobiomin dynamiikkaa (Cui, Morris ym. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016) ja selvittää immuunivälitteisiä vasteita, jotka ovat vastuussa peruuttamattomista keuhkovaurioista, jotka voivat seurata keuhkojen dysbioosia HIV:n taustalla. infektio (Hutchinson, Vlahos et al. 2014, Wang, Bafadhel ym. 2016). Keuhkojen dysbioosin roolin ymmärtäminen HIV:hen liittyvän keuhkoahtaumataudin patogeneesissä on äärimmäisen tärkeää afrikkalaisissa ympäristöissä, joissa HIV/AIDS-taakka on suurin (Cassol, Cassetta ym. 2010, Morris, George ym. 2011).

Tutkimushypoteesi

Muuttunut keuhkojen mikrobiomi HIV-tartunnan saaneilla henkilöillä liittyy krooniseen obstruktiiviseen keuhkosairauteen (COPD).

Erityiset tavoitteet

1. Keuhkojen mikrobiomin määrittäminen HIV-tartunnan saaneiden ja tartunnan saamattomien henkilöiden kesken, joilla ei ole COPD:tä (terveet kontrollit).
2. Keuhkojen mikrobiomin määrittäminen keuhkoahtaumatautia sairastavien HIV-tartunnan saaneiden henkilöiden keskuudessa.
3. Vertaa keuhkomikrobiomia HIV-tartunnan saaneiden COPD-potilaiden ja HIV-negatiivisten keuhkoahtaumatautia sairastavien henkilöiden kesken.
4. Selvittää keuhkojen mikrobiomin ja COPD:n välinen yhteys HIV-tartunnan saaneilla henkilöillä.

Ongelmailmoitus

Vaikka länsimaissa tehdään tällä hetkellä useita tutkimuksia keuhkojen mikrobiomista ja sen roolista keuhkoahtaumataudin pahenemisvaiheissa (Cui, Morris ym. 2014, Sze, Hogg ym. 2014, Wang, Bafadhel et al. 2016), niitä on rajoitetusti. kirjallisuus HIV:n roolista COPD:n patogeneesissä (Morris, George ym. 2011, Drummond, Kunisaki et al. 2016). Vielä ei tiedetä, miksi HIV-tartunnan saaneille henkilöille kehittyy keuhkoahtaumatauti, jonka esiintyvyys on suurempi kuin HIV-negatiivisten kollegoidensa (Morris, George ym. 2011). Tällä hetkellä ei ole tietoa keuhkojen mikrobiomista Saharan eteläpuolisen Afrikan yleisessä väestössä, mukaan lukien Ugandassa. Tutkimusta tarvitaan kiireesti keuhkomikrobiomin kuvaamiseksi yksilöillä, joilla ei ole COPD:tä ja keuhkoahtaumatautien patogeneesin selvittämiseksi HIV:ssä (Morris, George ym. 2011, Drummond, Kunisaki ym. 2016).

Perustelut

Keuhkojen mikrobiomin ja HIV:hen liittyvän keuhkoahtaumatautien välisen yhteyden löytäminen on äärimmäisen tärkeää Afrikan ympäristössä, jossa HIV/AIDS-taakka on suurin. Tällaisesta tutkimuksesta saatava tieto ohjaa optimaalisten keuhkoahtaumatautien seulonta- ja hoitostrategioiden kehittämistä HIV-populaatiossa.

menetelmät

Poikkileikkaustutkimus tehdään HIV-tartunnan saaneille henkilöille, jotka osallistuvat ART-klinikoihin Nakasekessa, ja HIV-negatiivisille henkilöille Lung Function in Nakasekessa (LiNK) -tutkimuksesta.

Arvioitu otoskoko

Hypoteesitestauksen ja teholaskelmien soveltaminen taksonomiseen perustuviin ihmisen mikrobiomitietoihin käyttämällä Human Microbiome project-R (HMP-R) -tilastopakettia (versio 1.4.3), joka toimii Dirichlet-multinomiaalimallilla[33], Merkitystasolle (alfa) asetettu = 5 %), osallistujien määrä N = 50; sekvenssilukemien määrä ≥ 20 000 (katsotaan katkaisuksi laadunvalvonnassa), teho ≥ 99,99 % (tämä teho riittää havaitsemaan tehosteen koon, jonka odotetaan havaittavan sekvenssitiedoissa). Kun otetaan huomioon 20 % osallistumattomuusprosentti, kunkin ryhmän otoskoko on 63 osallistujaa.

Opintopaikan valinta

Nakaseken piirin ART-klinikat on valittu tutkimuskohteiksi meneillään olevan COPD/HIV-tutkimuksen vuoksi, jonka tavoitteena on määrittää COPD:n esiintyvyys ja siihen liittyvät tekijät HIV:ssä. Yli 752 HIV-tartunnan saanutta henkilöä on seulottu COPD:n varalta standardiohjeiden mukaisesti. Lisäksi LiNK-tutkimus (Lung Function in Nakaseke ja Kampala (LiNK), PI: Kirenga, Checkley) tehtiin myös Nakasekessa. Se oli väestöpohjainen havainnointitutkimus, jossa arvioitiin keuhkoahtaumatautien esiintyvyyttä, riskitekijöitä ja oireita Nakaseken maaseutuyhteisöissä käyttämällä ositettua satunnaisotantaa, jossa oli 1000 yli 35-vuotiasta henkilöä ja Nakaseken kokopäiväistä asukasta.

Näytteenottomenettely

Epi-työkalun satunnaislukugeneraattorin (La Rosa, Brooks ym. 2012) avulla tutkimushenkilöstö valitsee kohderyhmistämme 63 osallistujaa kohortteistamme. Tutkimusavustaja dokumentoi heidän ikänsä, sukupuolensa ja tupakointihistoriansa. COPD+HIV+-ryhmää käytetään tunnistamaan osallistujat muista ryhmistä.

Opintosuunnitelma

Nakaseke ART -klinikoilla työskentelevät koulutetut tutkimusavustajat ja lääkäri. Satunnaisesti valittuihin osallistujiin ollaan yhteydessä puhelimitse. Tutkimusryhmä selittää protokollan osallistujille ja jos kiinnostuit, tutkimusassistentti suunnittelee opintovierailun. He saavat osallistujilta tietoisen suostumuksen ja tehdään perusspirometria. Tutkimushenkilöstö suorittaa ysköksen induktion normaalin toimintatavan mukaisesti. Indusoidut yskösnäytteet kerätään käyttämällä ysköksen DNA-keräys-, säilytys- ja eristyssarjoja valmistajan ohjeiden mukaisesti. Säilöntäaineen komponentit mahdollistavat kerättyjen näytteiden säilytyksen yli 2 vuoden ajan ilman havaittavaa DNA:n hajoamista.

Näytteen käsittely

Näyte käsitellään normaalin toimintatavan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna yskösnäytteet laitetaan tiiviiseen biovaarapussiin, jossa on suljetut kannet ja imukykyinen materiaali. Kaikki näytteet kuljetetaan paikallisten ja kansallisten säännösten mukaisesti, jotka koskevat mahdollisesti tarttuvien materiaalien kuljetusta.

Näytteenkäsittelyn ydinlaboratorio

Näytteiden käsittelyyn käytetään molekyylidiagnostiikkalaboratoriota ja Integrated Biorepository -laboratoriota, jotka sijaitsevat Makereren yliopiston terveystieteiden korkeakoulussa Medical Microbiology -rakennuksen 3. kerroksessa.

Genomisen DNA:n uuttaminen

Bakteerien genominen DNA uutetaan 200 mikrolitrasta yskösnäytteistä kaupallisesti saatavilla olevilla sarjoilla.

Genomisen DNA:n uuttokontrollit

ZymoBIOMICS Microbial Community Standardia käytetään positiivisena näytekontrollina DNA-näytteitä valmistettaessa. DNA Collection Kitin säilytyspuskuria, johon ei ole lisätty näytettä, käytetään negatiivisena kontrollina.

V3- ja V4-hypervariaabelin alueen polymeraasiketjureaktion (PCR) monistus

16S-rRNA-geenin V3- ja V4-hypervariaabeli alue monistetaan PCR-menetelmällä käyttämällä kaupallisesti saatavia alukkeita.

16S rRNA:n sekvensointi

DNA-sekvensointi tehdään erissä käyttämällä MiSeq-sekvensointialustaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jokainen erä koostuu satunnaistetuista näytteistä kahdesta ryhmästä. 1x26 MiSeq-ajo suoritetaan klusteritiheyden ja näytteiden normalisoinnin tarkistamiseksi. MiSeq Reporter 2.3:n Illumina metagenomics -työnkulkua käytetään indeksoitujen lukujen purkamiseen, sekvenssitiedostojen luomiseen ja lukujen luokitteluun. Heikkolaatuisten ja kimeeristen lukemien poistamiseen käytetään tiukkoja kriteerejä.

Tilastollinen analyysi

Erityistavoitteelle 1, 2 ja 3

1. Klusteri 16SrRNA-sekvenssi lukee OTU:ihin:

   Laadunvalvonnan ja tietojen puhdistuksen jälkeen loput lukemat alistetaan avoimelle viiteoperatiiviselle taksonomiselle yksikölle (OTU) (97 %:n identiteettiraja), jossa lukemat klusteroidaan ensin Greengenes-referenssisekvenssejä vastaan. OTU:t harvennetaan pienimpään lukumääriin kaikista näytteistä, ja harvennettua OTU-taulukkoa käytetään alfa- ja beetadiversiteetin arvioimiseen. Suoritetaan pääkoordinaattianalyysi (PCoA) tulosten luotettavuuden arvioimiseksi.

2. Kohteen keuhkomikrobiomin koostumus verrattuna kontrolliryhmiin:

Tutkijat laskevat kaikkien tunnistettujen taksonomisten klustereiden (OTU) tai bakteerilajien keskimääräisen prosenttiosuuden kohdepopulaatiossa verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tiedot kootaan yhteen ja esitetään histogrammissa.

Tiettyyn tarkoitukseen 3

1. OTU:iden, kliinisen tilan (COPD/HIV) ja/tai kliinisen tiedon välillä kehitetään monimuuttujamalli. Tämä saavutetaan suorittamalla yleinen lineaarinen regressio kullekin jatkuvalle muuttujalle ja binääritulokselle. OTU:iden ja kliinisen dataryhmän välisen suhteen määrittämiseksi suoritetaan kanoninen vastaavuusanalyysi.

   Mikrobiomiaineiston osalta analyysiin sisällytetään OTU:t, joita on vähintään 10 %:ssa kaikista näytteistä. Kliinisen tietojoukon osalta muuttujat, jotka puuttuvat yli 50 %:sta kaikista näytteistä, jätetään pois puuttuvien arvojen vaikutusten minimoimiseksi. Kollineaarisuutta tarkastellaan parittaisella Pearsonin korrelaatiotestillä mikrobiomilla ja kliinisillä muuttujilla. Merkittävät mallikomponentit valitaan ristiinvalidoinnilla käyttämällä Auto-fit-vaihtoehtoa SIMCA-P:n oletuskriteereillä (Wang, Bafadhel et al. 2016).

2. OTU:n, HIV:n, keuhkoahtaumatautien tilan ja kliinisen tiedon välisen yhteyden mittaaminen Yhtenäisyyden verkosto muodostetaan korreloimalla yksittäisiä OTU:ita. Parittaisia ​​Pearsonin korrelaatiotestiä käytetään rinnakkaisestymissuhteiden merkittävyyden arvioimiseen, ja vain merkittävät korrelaatiot säilytetään (oikaistu P-arvo < 0,05). False Discovery Rate (FDR) -menetelmää käytetään koko ajan säätämään P-arvoja (adj. P) useille testeille (Wang, Bafadhel et al. 2016). Epävakaat reunat, joiden pisteet eivät ole 95 %:n luottamusvälillä bootstrap-jakaumasta, poistetaan verkosta. Puuttuvat arvot jätetään pois korrelaatiolaskelmista. OTU-verkon osalta 100 ylimmän ja 100 alimman luokan reunaa näytetään lopullisessa verkossa (Wang, Bafadhel et al. 2016).

Opiskelun rajoitukset

Tässä tutkimuksessa tutkimuksemme kattaa keuhkojen bakteeriyhteisöt, jotka tutkijat tunnistavat 16SrRNA-sekvensoinnilla. Tutkijat myöntävät, että muut mikrobiyhteisöt (virukset, sienet ja loiset) voivat vaikuttaa COPD:n patogeneesiin ja pahenemiseen.

Eettinen huomio

Ugandan kansallinen tiede- ja teknologianeuvosto (UNCST) ja Mulago Hospital Research Ethics Committee (MHREC) hyväksyivät tutkimuksen. Osallistujille ei tehdä invasiivisia toimenpiteitä, ja kaikkiin seulontoihin sisältyy tavallisia hoitopistelähestymistapoja.

Tietoon perustuva suostumusprosessi:

Luottamuksellisuus

Osallistujille annetaan yksilölliset tunnistenumerot heidän tunnistettavien tietojensa tilalle. Osallistujatietoihin ei liitetä osallistujan tunnisteita. Tutkimushenkilöstöllä on pääsy raakatietoihin. Kaikki tiedot tallennetaan salasanalla suojattuun, täysin salattuun tietokantaan, johon pääsevät vain tutkimushenkilöstö ja analysoinnista vastaavat tutkijat.