儿童和青少年的膳食、微生物群和心理健康 (MMM)

目前的试点研究将用于测试所用方法的可行性。 如果发现该方法可行，则此处申请的试点研究中的 n=40+ 病例和对照/兄弟姐妹将被纳入更大的研究。 对于被邀请参加和拒绝参加的病例，将从期刊中收集孩子最终医学诊断的信息，但不收集其他信息。 在目前的试点研究中（来自前 20 个病例、对照组和兄弟姐妹的信息），将询问参与者是否愿意给出不参与的理由（同时确保他们绝对不需要这样做）。

在研究数据管理公司 Smart Trial (https://www.smart-trial.co) 的帮助下，有关饮食、心理健康和背景数据的问卷将以网络为基础 将它们转换成可读的电子格式。 此程序已经过彻底的质量检查，将确保数据的正确存储。 根据冰岛食物成分数据库 (ISGEM)1,2 以及心理健康问卷分析软件，测试根据食物和补充剂摄入数据计算营养的饮食计划。

在门诊等候名单上时，监护人和孩子会收到邀请函。 如果在跟进电话后有兴趣参与，UNR 的项目代表将进行家访，并签署知情同意书。 在此阶段还会收到孩子老师的联系信息。 将提供一个工具包，包括用于收集生物样本的工具和良好的说明，以及一本用于三天饮食记录的小册子。 调查问卷收集了额外的信息，例如食物和补充剂摄入的短期验证频率、为冰岛食物环境设计的 ICEFFQII3、4、食物厌恶、身体疾病或诊断 ROMEIV5-7、特应性疾病 iFAAM8 和药物以及其他重要信息背景因素在线完成，每个参与者都有用于解锁问卷的代码。 本研究中使用的心理健康问卷均已在国际和冰岛得到验证。 这些都是; 1) 教师和家长报告：ADHD 评定量表 9-11、儿童行为检查表（TRF 和 CBCL）一系列症状检查表，旨在提供有关广泛的情绪和行为问题的信息。12-15； 高功能自闭症谱系筛查问卷 (ASSQ)16 和社会反应量表 (SRS)17-21。 2) 10 岁以上儿童的自我报告：儿童抑郁量表 (CDI)22-26 和儿童多维焦虑量表 (MASC)27,28-33。 此外，如果监护人允许，将从冰岛药物登记处 (IMR) 检索从出生到当前日期为孩子配发的处方药信息。 有关所用问卷的更多信息，请参见附录 1。

收集完案例数据后，冰岛大学社会科学研究所（SSRI）会在同一邮区内找到一名随机选择的儿童，性别和年龄相匹配，并通过发送介绍邀请参加一封信，然后是一个电话。 由于参与率可能较低，SSRI 将为完成研究的每个案例找到 5 个对照。 这些将按照 SSRI 提供的顺序调用。

生物样本最好在 3 天食品注册结束时收集，在监护人的帮助下，根据标准程序使用专用设备，包括稳定因素，并冷藏（4-8°C）。 然后，在靠近雷克雅未克、阿库雷里和周边地区时，研究人员会从病例和对照中收集该试剂盒以及食物日记。 参与者还可以将样品送到兰斯皮塔利大学医院的 BUGL 或营养部门。 对于其他地点，样本将被发送出去，包括关于如何在收集后将样本重新发送给研究人员的指南。 尿液样本将被分装到更小的试管中，与其他生物样本一起储存在大学医院或阿库雷里医院的实验室单元的 -80°C 冰箱中。 在招募的一年中，所有来到 BUGL 的患者的诊断都将被记录下来，以便能够检测数据收集中潜在的选择偏差。

数据输入工作将通过基于网络的问卷调查保持在最低限度，其中信息将直接输入数据表。 将使用三天食物日记和食物频率问卷 (ICEFFQII)3 计算当前饮食的信息，包括进餐频率、食物频率和食物摄入量，以及从食物和补充剂中摄入的能量、常量和微量营养素，以及关于厌恶食物。 使用儿童和青少年儿科功能性胃肠道疾病诊断问卷 (ROMEIV)34 和儿童特应性反应问卷 (iFAAM)8 评估身体疾病。 此外，还将收集父母关于怀孕和生育史、母乳喂养史、食物敏感史、排便频率、一生中的创伤、社会经济因素、身体活动、睡眠习惯和人体测量数据的问卷信息。 将在整个期间进行质量检查以及简单的描述性统计分析。

一些关于心理健康的问卷需要专门的软件才能运行，本研究将购买这些软件。 此外，将通过基于网络的调查问卷将信息直接输入数据表，从而将数据输入工作保持在最低限度。 病例的心理健康状况基于通常在很长一段时间内收集的最佳专家临床诊断，通常采用半结构化临床访谈。 这些纵向数据包含维度和分类数据（包括诊断），以及全面和多信息的临床信息（患者、父母、学校等）。 将从冰岛医学登记处 (IMR) 检索孩子出生后的用药信息。

所有样品将在研究期结束时的同一时间点进行测量，并被送到各自的位置进行分析。 在进行任何测量之前，样本将根据病例对照状态进行随机分配。 将测量以下内容：

1. 粪便样本、唾液和口腔拭子：将根据之前发布的针对 16S rDNA71-73 的方案进行微生物组鸟枪法分析，并将使用基于 PCR 的方法对从口腔拭子样本中分离的人类 DNA 进行基因分型。 将使用市售的 QIAamp PowerFecal DNA 提取试剂盒从拭子和粪便样本中提取高质量 DNA。 DNA 分离后将使用通用原核引物进行 PCR 扩增。 将使用 Illumina 高通量平台和使用标准协议的双末端模​​式进行测序。 生成的序列将使用端到端微生物组分析管道 QIIME 2 进行分析，以进行序列质量控制、嵌合体去除、将序列分配给样本和定义序列变异 (SV)。 SV 将使用 16S rRNA 参考数据库和系统发育多样性指标分配给分类学。 交互式可视化和统计数据将使用 QIIME 2 进行计算，以解释和比较微生物组的组成。 从肠道样本中收集的微生物多样性数据集将用于构建微生物群数据库。 将使用基于 PCR 的方法对从口腔交换样本中分离的人类 DNA 进行基因分型。
2. 尿液样本：在家中用装有肽抑制剂的试管收集晨尿样本。 尿液被分成两个样本，一个用于在 HPLC 反相 (C-18) 色谱上对食物相关肽进行靶向分析，该色谱给出与肌酐相关的总肽量。 另一个尿液样本将用于非靶向代谢组学分析 (LC-ESI-qTOF-MS)。
3. 血液样本：炎症生物标志物将通过基于中尺度发现平台（例如 CRP、白细胞介素）和营养状况（血红蛋白、铁蛋白、叶酸、维生素 B12、25-羟基维生素-D、⍵-3 脂肪酸，由 Landspitali 实验室的试剂盒提供。 来自血清的连蛋白的测量将通过基于竞争性 ELISA 方法的测定法进行。 35

对于每种类型的组学和生物标志物数据（微生物群、代谢组学、食品相关肽、炎症因子、营养素），数据生成小组将协调和执行适当的预处理和质量控制，如上所述。 所有数据都将被适当地规范化和转换，检查潜在的批次效应并删除异常值。 将研究年龄、性别、体重指数、布里斯托尔粪便量表（用于肠道微生物组）、药物或饮食等潜在混杂因素的影响。 对于每种数据类型，我们将比较案例和两个控制组，但也会分别查看不同变量之间的关联以及与子组的关联，使用多变量模型，包括对混杂变量的调整。 Benjamini-Hochberg 错误发现率将用于纠正多重假设检验。

对于口腔和肠道微生物组数据，我们将执行主坐标分析以研究样本之间的组成差异。 病例组和对照组将在微生物多样性（α-和β-多样性）和分类丰度方面进行比较。 在这里，我们将应用为微生物组数据开发的方法来解释微生物群落的稀疏性和采样不足，例如在 R 包中实施的方法。 36 微生物物种之间的相关性将使用 sparCC37 绘制，它专为微生物相对丰度等组成数据而设计，并在病例组和对照组之间进行比较，以揭示微生物群落结构的潜在差异。 对于饮食数据，FFQ 将通过 PCA 进行分析，确定各组的饮食模式，而三天的登记将用于计算更准确的食物摄入量，计算为营养素（能量、常量营养素（蛋白质、脂肪、碳水化合物） /纤维））和微量营养素（维生素、矿物质和其他重要因素）。 此外，饮食数据以及有关营养状况、炎症因子和组学数据的信息将用于研究与口腔和粪便微生物群的关联。 同样的分析也将在更大的子组中进行，例如患有多动症或自闭症的儿童。 研究参与者的基因型数据将用于研究宿主基因锚如何预测特定微生物群或与特定微生物群相互作用。 在这里，我们将重点关注以前与微生物群组成或精神疾病相关的遗传变异。

整合不同类型的高维组学数据是一项具有挑战性的任务，可以采用多种方法。 基于使用共丰度聚类对组学数据进行降维的计算框架 38 已经被揭示 39，随后是侧重于病例和对照之间不同特征的交叉组学相关分析。 此外，我们将应用最近审查的其他类型的组学整合方法40、41，例如稳健的稀疏典型相关、协惯性或 Procrustes 分析，以识别心理健康背景下组学和饮食数据的共享模式。