Måltider, mikrobiota og mental sundhed hos børn og unge (MMM)

Den nuværende pilotundersøgelse vil blive brugt til at teste gennemførligheden af ​​de anvendte metoder. Hvis metoden findes at være gennemførlig, vil n=40+ tilfælde og kontroller/søskende i den pilotundersøgelse, der søges her, indgå i den større undersøgelse. For de sager, der inviteres til at deltage og afslå deltagelse, vil oplysninger om endelig medicinsk diagnose af barnet blive indsamlet fra journaler, men ingen andre oplysninger. I den aktuelle pilotundersøgelse (information fra de første 20 cases, kontroller og søskende) vil deltagerne blive spurgt, om de er villige til at begrunde ikke at deltage (samtidigt som de er sikret, at de absolut ikke behøver at gøre det).

Spørgeskemaer om kost, mental sundhed og baggrundsdata vil være webbaserede med hjælp fra forskningsdataadministrationsfirmaet Smart Trial (https://www.smart-trial.co) omdanne dem til et læsbart elektronisk format. Denne procedure er blevet grundigt kvalitetskontrolleret og vil sikre korrekt opbevaring af data. Test af kostprogrammerne til næringsstofberegninger fra kost- og kosttilskudsdata, baseret på den islandske fødevaresammensætningsdatabase (ISGEM)1,2 samt software til analyse af mental sundhed spørgeskemaer.

Mens de er på venteliste til at komme i ambulatoriet, vil værger og barn modtage invitationsbreve. Ved interesse i at deltage efter en opfølgende telefonsamtale følger et hjemmebesøg fra projekt stedfortræder i UNR, hvor det informerede samtykke underskrives. Kontaktoplysninger til barnets lærer modtages også på dette tidspunkt. Et sæt med værktøjer til at indsamle biologiske prøver med gode instruktioner samt et hæfte til den tre-dages kostregistrering vil blive leveret. Spørgeskemaerne, der indsamler yderligere information såsom den korte validerede frekvens for mad- og kosttilskudsindtag, ICEFFQII, designet til det islandske fødevaremiljø3,4, fødevareaversioner, fysiske lidelser eller diagnose ROMEIV5-7, atopiske sygdomme iFAAM8 og medicin samt andre vigtige baggrundsfaktorer udfyldes online, hvor hver deltager har koder, der bruges til at låse spørgeskemaerne op. Spørgeskemaerne til mental sundhed, der blev brugt i denne undersøgelse, er alle blevet valideret internationalt såvel som i Island. Disse er; 1) Lærer- og forældrerapporter: ADHD-vurderingsskalaen 9-11, børneadfærdstjeklisten (TRF og CBCL) en familie af symptomtjeklister udviklet til at give information om en bred vifte af følelsesmæssige og adfærdsmæssige problemer.12-15; det højfungerende autismespektrumscreeningsspørgeskema (ASSQ)16 og Social Responsiveness Scale (SRS)17-21. 2) Selvrapporter for børn >10 år: Children's Depression Inventory (CDI)22-26 og Multi-Dimensional Anxiety Scale for Children (MASC)27,28-33. Desuden vil oplysninger om receptpligtig medicin udleveret til barnet fra fødslen til den nuværende dato blive hentet fra det islandske medicinregister (IMR), hvis det er tilladt af værgene. Yderligere information om de anvendte spørgeskemaer findes i bilag 1.

Efter indsamlingen af ​​data fra sagen vil et tilfældigt udvalgt barn, matchet efter køn og alder, blive fundet inden for samme postområde af Social Sciences Research Institute (SSRI) ved Islands Universitet og inviteres til at deltage ved at sende en introduktion brev, efterfulgt af et telefonopkald. SSRI finder 5 kontroller for hvert tilfælde, der har afsluttet undersøgelsen, da deltagelsesraten kan være lav. Disse vil blive kaldt i den rækkefølge, som SSRI'en giver.

De biologiske prøver skal fortrinsvis indsamles mod slutningen af ​​den 3-dages fødevareregistrering, med hjælp fra værger, i henhold til standardprocedure ved brug af dedikerede anordninger, inklusive stabiliseringsfaktorer, og opbevares koldt (4-8°C). Sættet bliver derefter indsamlet fra både sager og kontroller af forskerne sammen med maddagbogen, når de er tæt på Reykjavik, Akureyri og omgivelser. Deltagerne kan også aflevere prøverne enten til BUGL eller Ernæringsenheden, begge på Landspitali Universitetshospital. For andre steder vil prøverne blive sendt ud, herunder retningslinjer for, hvordan de sendes til forskerne igen efter deres indsamling. Urinprøverne vil blive fordelt i mindre rør til opbevaring på en laboratorieenhed på Universitetshospitalet eller Akureyri Hospital i en -80°C fryser sammen med de andre biologiske prøver. I løbet af rekrutteringsåret vil diagnosticering af alle patienter, der kommer til BUGL, blive registreret for at kunne opdage potentielle selektionsbias i dataindsamlingen.

Arbejdet med indlæsning af data vil blive holdt på et minimum gennem de webbaserede spørgeskemaer, hvor informationer vil blive indtastet direkte i datablade. Oplysninger om aktuel kost vil blive beregnet for måltidshyppighed, madhyppighed og fødeindtag samt energi-, makro- og mikronæringsstofindtag fra både fødevarer og kosttilskud ved hjælp af den tre-dages maddagbog og et fødevarehyppighedsspørgeskema (ICEFFQII)3 og information vedr. madaversioner. Fysiske lidelser evalueres ved hjælp af det diagnostiske spørgeskema for pædiatriske funktionelle gastrointestinale lidelser for børn og unge (ROMEIV)34 og et spørgeskema om atopiske reaktioner for børn (iFAAM)8. Derudover vil der blive indsamlet oplysninger fra forældrenes spørgeskemaer om historie om graviditet og fødsel, amning, historie om fødevarefølsomhed, afføringshyppighed, traumer i løbet af livet, socioøkonomiske faktorer, fysisk aktivitet, sovevaner og antropometriske data. Der vil blive udført kvalitetstjek i hele perioden samt simpel deskriptiv statistisk analyse.

Nogle af spørgeskemaerne om mental sundhed har brug for speciel software til at køre, som vil blive købt til denne undersøgelse. Endvidere vil arbejdet med input af data blive holdt på et minimum gennem de webbaserede spørgeskemaer, hvor informationer vil blive indtastet direkte i datablade. Tilfældenes mentale helbredsstatus er baseret på de bedste kliniske ekspertdiagnoser, som normalt er indsamlet over en lang periode, ofte med semistrukturerede kliniske interviews. Disse longitudinelle data indeholder både dimensionelle og kategoriske data (med diagnoser), med omfattende og multi-informant klinisk information (patient, forældre, skole osv.). Oplysninger om medicinering af barnet fra fødslen af ​​vil blive hentet fra det islandske medicinregister (IMR).

Alle prøver vil blive målt på samme tidspunkt i slutningen af ​​undersøgelsesperioden og sendes til deres respektive lokaliteter til analyse. Prøver vil blive randomiseret med hensyn til case-kontrolstatus, før der udføres målinger. Følgende vil blive målt:

1. Fækale prøver, spyt og mundvab: Mikrobiom-haglgeværanalyser vil blive udført i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller rettet mod 16S rDNA71-73, og genotypebestemmelse vil blive udført på humant DNA isoleret fra bukkalpodningsprøver ved hjælp af PCR-baserede metoder. Højkvalitets-DNA fra podepinde og fækale prøver vil blive ekstraheret ved hjælp af det kommercielt tilgængelige QIAamp PowerFecal DNA-ekstraktionssæt. DNA-isolering vil blive efterfulgt af PCR-amplifikation ved anvendelse af universelle prokaryote primere. Sekventering vil blive udført ved hjælp af en Illumina high-throughput platform og pair-end modalitet ved hjælp af standardprotokoller. De resulterende sekvenser vil blive analyseret ved hjælp af ende-til-ende mikrobiomanalysepipeline QIIME 2 til sekvenskvalitetskontrol, kimærefjernelse, tildeling af sekvenser til prøver og definition af sekvensvarianter (SV'er). SV'er vil blive tildelt taksonomi ved hjælp af 16S rRNA referencedatabaser og fylogenetiske diversitetsmetrikker. Interaktiv visualisering og statistik vil blive beregnet ved hjælp af QIIME 2 til at fortolke og sammenligne mikrobiomsammensætninger. Datasættene af mikrobiel diversitetsdata indsamlet fra tarmprøverne vil blive brugt til opbygningen af ​​en mikrobiotadatabase. Genotyping vil blive udført på humant DNA isoleret fra bukkale swap-prøver ved hjælp af PCR-baserede metoder.
2. Urinprøve: En morgenurinprøve opsamles hjemme i et rør med peptidhæmmere. Urinen opdeles i to prøver, den ene til analyse af målrettet analyse af fødevarerelaterede peptider på en HPLC omvendt fase (C-18) kromatografi, der giver den samlede peptidmængde relateret til kreatinin. Den anden urinprøve vil blive brugt til umålrettet metabolomisk profilering (LC-ESI-qTOF-MS).
3. Blodprøver: Inflammatoriske biomarkører vil blive analyseret ved multiplex immunoassays baseret på mesoscale opdagelsesplatformen (f.eks. CRP, interleukiner) og ernæringsstatus (hæmoglobin, ferritin, folinsyre, vitamin B12, 25-hydroxy-vitamin-D, ⍵-3 fedtsyrer ved sæt i Landspitali-laboratoriet. Målinger af zonulin fra serum vil blive udført ved assay baseret på metoden med kompetitiv ELISA.35

For hver type omics og biomarkørdata (mikrobiota, metabolomics, fødevarerelaterede peptider, inflammatoriske faktorer, næringsstoffer) vil passende forbehandling og kvalitetskontrol blive koordineret og udført af de datagenererende grupper som angivet ovenfor. Alle data vil blive korrekt normaliseret og transformeret, kontrolleret for potentielle batch-effekter og afvigelser fjernet. Effekterne af potentielle konfoundere såsom alder, køn, kropsmasseindeks, Bristol afføringsskala (til tarmmikrobiom), medicin eller diæt vil blive undersøgt. For hver datatype vil vi sammenligne case- og to kontrolgrupper, men også se på sammenhænge mellem de forskellige variable separat samt i forhold til undergrupper, ved hjælp af multivariate modeller inklusive justeringer for konfoundervariabler. Benjamini-Hochbergs falske opdagelsesrate vil blive brugt til at korrigere for test af flere hypoteser.

For orale og intestinale mikrobiomdata vil vi udføre principiel koordinatanalyse for at undersøge sammensætningsforskellene mellem prøver. Case- og kontrolgrupperne vil blive sammenlignet med hensyn til mikrobiel diversitet (alfa- og beta-diversitet) og taksonomiske forekomster. Her vil vi anvende metoder udviklet til mikrobiomdata for at tage højde for sparsitet og undersampling af det mikrobielle samfund, såsom implementeret i R-pakken.36 Korrelationer mellem mikrobielle arter vil blive kortlagt ved hjælp af sparCC37, som er designet til sammensætningsdata såsom mikrobielle relative overflod, og sammenlignet mellem case- og kontrolgrupper for at afsløre potentielle forskelle i mikrobiomsamfundets struktur. For kostdataene vil FFQ'erne blive analyseret gennem PCA, der identificerer kostmønstre i grupperne, mens tre-dages registreringen vil blive brugt til at beregne et mere nøjagtigt indtag af fødevarer, beregnet fremad i næringsstoffer (energi, makronæringsstoffer (protein, fedt, kulhydrater) /fibre)) og mikronæringsstoffer (vitaminer, mineraler og andre vigtige faktorer). Yderligere vil kostdata samt information om ernæringsstatus, inflammatoriske faktorer og omics-data blive brugt til at studere sammenhænge med oral og fækal mikrobiota. Samme analyse vil også blive lavet i de større undergrupper for eksempel børn med ADHD eller autisme. Genotypedata om studiedeltagere vil blive brugt til at undersøge, hvordan værtsgenankre kan forudsige eller interagere med en bestemt mikrobiota. Her vil vi fokusere på genetiske varianter, der tidligere var forbundet med mikrobiotasammensætning eller psykiatriske lidelser.

Integrering af forskellige typer højdimensionelle omics-data er en udfordrende opgave, og flere tilgange kan udføres. En beregningsramme for en sådan analyse38 er blevet afsløret39, baseret på dimensionalitetsreduktion af omics-dataene ved hjælp af co-abundance clustering, efterfulgt af cross-omics-korrelationsanalyse, der er fokuseret på funktioner, der adskiller sig mellem tilfældene og kontrollerne. Derudover vil vi anvende andre typer omics-integrationstilgange som for nyligt gennemgået40,41, såsom robust sparsom kanonisk korrelation, co-inerti eller Procrustes-analyse, for at identificere delte mønstre på tværs af omics og kostdata i forbindelse med mental sundhed.