Comidas, Microbiota y Salud Mental de Niños y Adolescentes (MMM)

El estudio piloto actual se utilizará para probar la viabilidad de los métodos utilizados. Si se determina que la metodología es factible, los n=40+ casos y controles/hermanos en el estudio piloto solicitado aquí se incluirán en el estudio más amplio. Para aquellos casos que sean invitados a participar y rechacen la participación, la información sobre el diagnóstico médico final del niño se recopilará de los diarios, pero ninguna otra información. En el estudio piloto actual (información de los primeros 20 casos, controles y hermanos), se preguntará a los participantes si están dispuestos a dar razones para no participar (mientras que al mismo tiempo se les asegurará que no es absolutamente necesario que lo hagan).

Los cuestionarios sobre dieta, salud mental y antecedentes se publicarán en la web con la ayuda de la empresa de gestión de datos de investigación Smart Trial (https://www.smart-trial.co) transformándolos en un formato electrónico legible. La calidad de este procedimiento se ha comprobado minuciosamente y garantizará el almacenamiento adecuado de los datos. Probar los programas dietéticos para los cálculos de nutrientes a partir de los datos de ingesta de alimentos y suplementos, basados ​​en la base de datos de composición de alimentos de Islandia (ISGEM)1,2, así como el software para el análisis de cuestionarios de salud mental.

Mientras esté en la lista de espera para acudir a la clínica ambulatoria, los tutores y el niño recibirán cartas de invitación. Si está interesado en participar después de una llamada telefónica de seguimiento, sigue una visita domiciliaria del diputado del proyecto de la UNR, donde se firma el consentimiento informado. En esta etapa también se recibe la información de contacto del maestro del niño. Se proporcionará un kit que incluye herramientas para recolectar muestras biológicas con buenas instrucciones, así como un folleto para el registro dietético de tres días. Los cuestionarios que recopilan información adicional, como la breve frecuencia validada sobre la ingesta de alimentos y suplementos, el ICEFFQII, diseñado para el entorno alimentario islandés3,4, las aversiones alimentarias, las dolencias físicas o el diagnóstico ROMEIV5-7, las enfermedades atópicas iFAAM8 y la medicación, así como otros importantes los factores de antecedentes se completan en línea y cada participante tiene códigos que se usan para desbloquear los cuestionarios. Todos los cuestionarios de salud mental utilizados en este estudio han sido validados internacionalmente, así como en Islandia. Estos son; 1) Informes de maestros y padres: las escalas de calificación de TDAH 9-11, la lista de verificación de comportamiento infantil (TRF y CBCL), una familia de listas de verificación de síntomas desarrolladas para proporcionar información sobre una amplia gama de problemas emocionales y de comportamiento. 12-15; el Cuestionario de detección del espectro autista de alto funcionamiento (ASSQ)16 y la Escala de respuesta social (SRS)17-21. 2) Autoinformes para niños >10 años: Inventario de Depresión Infantil (CDI)22-26 y Escala de Ansiedad Multidimensional para Niños (MASC)27,28-33. Además, si los tutores lo permiten, la información sobre los medicamentos recetados dispensados ​​al niño desde el nacimiento hasta la fecha actual se recuperará del Registro de Medicina de Islandia (IMR). En el Anexo 1 se puede encontrar más información sobre los cuestionarios utilizados.

Después de la recopilación de datos del caso, el Instituto de Investigación de Ciencias Sociales (SSRI) de la Universidad de Islandia encontrará a un niño seleccionado al azar, emparejado por sexo y edad, dentro de la misma área postal y se le invitará a participar enviando una presentación. carta, seguida de una llamada telefónica. El ISRS encontrará 5 controles para cada caso que haya finalizado el estudio, ya que la tasa de participación podría ser baja. Estos serán llamados en la secuencia proporcionada por el SSRI.

Las muestras biológicas deben recolectarse preferiblemente hacia el final del registro de alimentos de 3 días, con la ayuda de tutores, de acuerdo con el procedimiento estándar utilizando dispositivos dedicados, incluidos los factores de estabilización, y almacenadas en frío (4-8 °C). Luego, los investigadores recopilan el kit de casos y controles junto con el diario de alimentos cuando están cerca de Reykjavik, Akureyri y sus alrededores. Los participantes también pueden entregar las muestras a BUGL oa la Unidad de Nutrición, ambas en el Hospital Universitario Landspitali. Para otros lugares, las muestras se enviarán con pautas sobre cómo reenviarlas a los investigadores después de su recolección. Las muestras de orina se dividirán en alícuotas en tubos más pequeños para almacenarlas en una unidad de laboratorio en el Hospital Universitario o el Hospital Akureyri en un congelador a -80°C junto con las demás muestras biológicas. A lo largo del año de reclutamiento se registrará el diagnóstico de todos los pacientes que acudan a BUGL para poder detectar posibles sesgos de selección en la recogida de datos.

El trabajo de ingreso de datos se reducirá al mínimo a través de los cuestionarios basados ​​en la web, donde la información se ingresará directamente en las hojas de datos. La información sobre la dieta actual se calculará para la frecuencia de las comidas, la frecuencia de los alimentos y la ingesta de alimentos, así como la ingesta de energía, macro y micronutrientes de los alimentos y suplementos utilizando el diario de alimentos de tres días y un cuestionario de frecuencia de alimentos (ICEFFQII)3 e información sobre aversiones a la comida. Las dolencias físicas se evalúan mediante el cuestionario diagnóstico de trastornos funcionales gastrointestinales pediátricos para niños y adolescentes (ROMEIV)34 y un cuestionario sobre reacciones atópicas para niños (iFAAM)8. Además, se recogerá información de los cuestionarios de los padres sobre antecedentes de embarazo y parto, lactancia, antecedentes de sensibilidad alimentaria, frecuencia de defecaciones, traumas durante la vida, factores socioeconómicos, actividad física, hábitos de sueño y datos antropométricos. Se realizarán controles de calidad a lo largo del período así como análisis estadísticos descriptivos simples.

Algunos de los cuestionarios sobre salud mental necesitan un software especial para funcionar, que se comprará para este estudio. Además, el trabajo de ingreso de datos se reducirá al mínimo a través de los cuestionarios basados ​​en la web, donde la información se ingresará directamente en las hojas de datos. El estado de salud mental de los casos se basa en los mejores diagnósticos clínicos expertos, generalmente recopilados durante un largo período de tiempo, a menudo con entrevistas clínicas semiestructuradas. Estos datos longitudinales contienen datos tanto dimensionales como categóricos (con diagnósticos), con información clínica integral y multiinformante (paciente, padres, escuela, etc.). La información sobre la medicación del niño desde el nacimiento se obtendrá del Registro de Medicina de Islandia (IMR).

Todas las muestras se medirán en el mismo momento al final del período de estudio y se enviarán a sus respectivas ubicaciones para su análisis. Las muestras se aleatorizarán con respecto al estado de casos y controles antes de realizar cualquier medición. Se medirá lo siguiente:

1. Muestras fecales, saliva e hisopo bucal: los análisis de microbioma Shotgun se realizarán de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente dirigidos a 16S rDNA71-73 y la genotipificación se realizará en ADN humano aislado de muestras de hisopo bucal utilizando métodos basados ​​en PCR. Se extraerá ADN de alta calidad de muestras de hisopos y heces utilizando el kit de extracción de ADN QIAamp PowerFecal disponible en el mercado. Al aislamiento del ADN le seguirá la amplificación por PCR utilizando cebadores procarióticos universales. La secuenciación se realizará utilizando una plataforma Illumina de alto rendimiento y una modalidad de extremo de par utilizando protocolos estándar. Las secuencias resultantes se analizarán utilizando la canalización de análisis de microbioma de extremo a extremo QIIME 2 para el control de calidad de la secuencia, la eliminación de quimeras, la asignación de secuencias a las muestras y la definición de variantes de secuencia (SV). Los SV se asignarán a la taxonomía utilizando bases de datos de referencia 16S rRNA y métricas de diversidad filogenética. La visualización interactiva y las estadísticas se calcularán utilizando QIIME 2 para interpretar y comparar las composiciones de microbiomas. Los conjuntos de datos de diversidad microbiana recopilados de las muestras intestinales se utilizarán para la construcción de una base de datos de microbiota. El genotipado se realizará en ADN humano aislado de muestras de intercambio bucal utilizando métodos basados ​​en PCR.
2. Muestra de orina: Se recolecta una muestra de orina de la mañana en casa en un tubo con inhibidores peptídicos. La orina se divide en dos muestras, una para el análisis de análisis dirigido de péptidos relacionados con los alimentos en una cromatografía HPLC de fase inversa (C-18) que proporciona la cantidad total de péptidos relacionados con la creatinina. La otra muestra de orina se utilizará para perfiles metabolómicos no dirigidos (LC-ESI-qTOF-MS).
3. Muestras de sangre: los biomarcadores inflamatorios se analizarán mediante inmunoensayos multiplex basados ​​en la plataforma de descubrimiento de mesoescala (p. PCR, interleucinas) y estado nutricional (hemoglobina, ferritina, ácido fólico, vitamina B12, 25-hidroxi-vitamina-D, ácidos grasos ⍵-3 mediante kits en el laboratorio Landspitali. Las mediciones de zonulina en suero se realizarán mediante ensayo basado en el método de ELISA competitivo.35

Para cada tipo de datos ómicos y de biomarcadores (microbiota, metabolómica, péptidos relacionados con los alimentos, factores inflamatorios, nutrientes), los grupos de generación de datos coordinarán y realizarán el preprocesamiento y el control de calidad adecuados, como se indicó anteriormente. Todos los datos se normalizarán y transformarán adecuadamente, se comprobarán los posibles efectos por lotes y se eliminarán los valores atípicos. Se investigarán los efectos de posibles factores de confusión como la edad, el sexo, el índice de masa corporal, la escala de heces de Bristol (para el microbioma intestinal), la medicación o la dieta. Para cada tipo de datos, compararemos el caso y dos grupos de control, pero también veremos las asociaciones entre las diferentes variables por separado y en relación con los subgrupos, utilizando modelos multivariados que incluyen ajustes para las variables de confusión. La tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg se utilizará para corregir las pruebas de hipótesis múltiples.

Para los datos de microbiomas orales e intestinales, realizaremos análisis de coordenadas principales para investigar las diferencias de composición entre las muestras. Los grupos de casos y controles se compararán con respecto a la diversidad microbiana (diversidad alfa y beta) y abundancias taxonómicas. Aquí aplicaremos métodos desarrollados para datos de microbiomas para tener en cuenta la escasez y el bajo muestreo de la comunidad microbiana, tal como se implementó en el paquete R.36 Las correlaciones entre las especies microbianas se mapearán utilizando sparCC37, que está diseñado para datos de composición, como la abundancia relativa de microbios, y se compararán entre grupos de casos y controles para revelar posibles diferencias en la estructura de la comunidad de microbiomas. Para los datos dietéticos, los FFQ se analizarán a través de PCA identificando patrones dietéticos en los grupos, mientras que el registro de tres días se usará para calcular una ingesta más exacta de alimentos, calculada hacia adelante en nutrientes (energía, macronutrientes (proteínas, grasas, carbohidratos) /fibras)) y micronutrientes (vitaminas, minerales y otros factores importantes). Además, los datos dietéticos, así como la información sobre el estado nutricional, los factores inflamatorios y los datos ómicos, se utilizarán para estudiar las asociaciones con la microbiota oral y fecal. El mismo análisis también se realizará en los subgrupos más grandes, por ejemplo, niños con TDAH o autismo. Los datos del genotipo de los participantes del estudio se utilizarán para investigar cómo los anclajes genéticos del huésped podrían predecir o interactuar con una microbiota particular. Aquí nos centraremos en variantes genéticas previamente asociadas con la composición de la microbiota o trastornos psiquiátricos.

La integración de diferentes tipos de datos ómicos de alta dimensión es una tarea desafiante y se pueden emprender múltiples enfoques. Se ha revelado un marco computacional para este tipo de análisis38, basado en la reducción de la dimensionalidad de los datos ómicos mediante el agrupamiento de coabundancia, seguido de un análisis de correlación de ómicas cruzadas que se centra en las características que difieren entre los casos y los controles. Además, aplicaremos otros tipos de enfoques de integración ómica como se revisó recientemente40,41, como la correlación canónica dispersa robusta, la coinercia o el análisis de Procrustes, para identificar patrones compartidos entre las ómicas y los datos dietéticos en el contexto de la salud mental.