COPD 中的米托喹

引言 慢性阻塞性肺病 (COPD) 的特征是进行性和不可逆的气道阻塞，主要影响小气道（慢性阻塞性细支气管炎），与肺实质破坏（肺气肿）相关。 45 岁以上的人中有 10% 患有慢性阻塞性肺病。 预计到 2020 年，COPD 将成为世界第三大死因。 在西方国家，慢性阻塞性肺病的主要原因是呼吸道长期接触烟草烟雾，大量有毒物质和活性氧 (ROS) 进入人体，诱发氧化应激 (OS)。 COPD 中的 OS 既有外源性（吸入 ROS）也有内源性（烟草毒物和自身疾病诱导的 ROS）。 一、免疫系统等）。

线粒体功能障碍在氧化应激、细胞衰老和慢性炎症中起着重要但并非唯一的作用。 因此，更好地了解 COPD 背后的线粒体功能障碍将有可能更好地了解生理病理学并确定新的可能的治疗靶点。 COPD 在支气管肺、肌肉和免疫区域的线粒体改变在形态学和病理生理学上都有广泛的记载。线粒体功能障碍可能是原发性的（先天性的）或继发性的（后天性的，如吸烟的情况）。 这是一个广泛的概念，包括细胞能量产生受损、ROS 或线粒体克雷布斯循环中某些代谢物的过度生成，以及线粒体必需成分质量控制的丧失，最终导致线粒体内分子（mtDNA、ATP、细胞色素 c、Romo1 等）到细胞质和细胞外液中。 其中一些分子的行为类似于 DAMP（损伤相关分子模式）并诱导先天免疫的激活，从而引发炎症。 细胞色素 C 和 Romo1 的血液水平已被提议作为氧化应激的标志物。 线粒体的主要功能是产生 ATP，ATP 是维持活细胞的基本能量携带分子。 ATP 的产生是由线粒体中的其他能量前体通过耦合到电子传输链 (OXPHOS/ETC) 的氧化磷酸化系统产生的。 这些细胞器还在以下方面发挥着重要作用：1) 碳水化合物、脂质和蛋白质的特定代谢物的产生，这些代谢物对多种细胞功能至关重要，2) 血红素和类固醇激素的合成，3) 细胞“簇”的管理Fe 和 S，4) 细胞内钙的细胞稳态，5) 先天性和后天性免疫反应，以及 6) 某些类型细胞凋亡的调节。

细胞对它们所暴露的环境变化不断做出反应。 在细胞应激的情况下（例如 热量剥夺、特定营养素缺乏、温度变化等）细胞核通过向线粒体发送信号作出反应，使它们修改其功能以适应变化（从细胞核到线粒体的顺行信号：例如体育锻炼消耗肌肉细胞中的 ATP，激活 AMPK，AMPK 激活核转录辅因子 PGC-1alpha，后者又激活 OXPOS/ETC 和线粒体生物发生）。 另一方面，当线粒体本身存在压力情况时（例如 氧自由基、未展开的线粒体内蛋白质等的过度产生）信号被发送到细胞核，以修改旨在预防/纠正线粒体损伤的蛋白质的产生，包括伴侣蛋白、抗氧化剂或蛋白水解酶蛋白水解（自主或细胞内逆行信号） .

线粒体最近被证明能够直接或间接产生肽，这些肽不仅影响产生它们的自身细胞，而且它们具有远距离效应（非自主或细胞外逆行信号）。 这些由 Dillin 小组发现的物质被称为线粒体喹，它们会从线粒体受压的组织向全身发送信号，这些激素是让整个生物体准备好应对将要承受的细胞压力的激素。

当存在任何类型的线粒体应激（mtDNA 中的先天性或后天性突变、产生氧化应激的 OXPHOS/ETC 疾病、线粒体毒素等）时，会释放米托喹。 在哺乳动物中，线粒体应激通常与所谓的应激综合细胞反应 (ICRS) 相关。 ICRS 最重要的机制之一是 UPR（未折叠蛋白反应），其中线粒体以协调的方式与内质网系统和细胞核一起参与。

至少有两种不同类型的线粒体：1) 初级线粒体，在线粒体 DNA (mtDNA) 中编码和 2) 次级肌细胞因子，在细胞核 DNA (nDNA) 中编码，其分泌通过从应激线粒体到细胞的激活信号调节nDNA（例如 ATF4 等）。 Humanin (HN)、MOTS-c（12 S-c 的线粒体 ORF）和六种类似于 humanin 的肽（SHLPs 1-6）被认为是主要的线粒体喹，尽管数量可能更高。 直到最近，人们还认为线粒体 DNA 仅编码 37 个基因（13 个只在线粒体中发现的肽，它们都是 ETC 的亚基，22 个转移 RNA -tRNA-，和 2 个核糖体 RNA -rRNA-）RNA。 我们现在知道 16s 和 12s rRNA 包含 sORF（“短开放阅读框”），可翻译 20-30 aa 的分泌肽。 目前尚不清楚是什么密切机制调节这些线粒体喹的合成和释放，尽管它​​们可能与线粒体核糖体激活有关。 关于 ATF4 激活下的次级线粒体喹（在核 DNA 中编码的那些），我们知道成纤维细胞生长因子 21 (FGF21)、生长和发育因子 15 (MIC1/GDF15)、卵泡抑素和中间体-肾上腺髓质素 2。 这些线粒体喹还对其他刺激作出反应，而与线粒体无关。

Humanin 是一种 21 或 24 个氨基酸的肽，具有多种细胞保护功能，可防止线粒体损伤（增加抗氧化剂和 4 种未折叠蛋白伴侣的合成）。 在许多组织中，它通过至少 2 个膜受体和与其他细胞内和细胞外蛋白的多种相互作用，具有抗炎作用（降低炎性细胞因子并提高抗炎细胞因子）和抗细胞凋亡（阻断细胞凋亡因子，如 Bak 和 IGFBP3） （神经系统、肝脏、心脏、血管壁、骨骼肌、视网膜色素上皮细胞、性腺等）。 它还具有有益的代谢作用（降低中枢水平的胰岛素抵抗，保护胰腺 β 细胞免受氧化应激，并与 IGF1 产生负反馈）。 最近已经证明，这种激素水平高的人随着年龄的增长认知障碍较少，而且也很长寿。

MOTS-c 是另一种 16 aa 的小肽，编码 mtDNA，但仅在胞质核糖体中合成，它还具有有益的抗氧化和代谢作用，因为它可以降低胰岛素抵抗并预防肥胖。 另一方面，它增加了对某些感染的抵抗力，增加和减少了骨吸收，因此它可能具有抗骨质疏松作用。 这两种激素都可以通过 ELISA 在血液中测量，尽管它们的血浆水平存在某些差异，具体取决于所使用的测试。

FGF21 是一种充分表征的激素，可刺激脂肪酸的生酮作用和 β 氧化作用。 它的分泌受禁食和受体 PPAR-α 激活的调节，但众所周知，它在激活线粒体到细胞核信号的任何线粒体应激情况下都会升高。 MIC1/GDF15 是另一种循环激素，可减少饥饿感，激活在极后区和孤束核中发现的特定受体水平 (GFRAL)。 已在癌症恶病质和许多其他情况下发现 GDF15 水平升高，其中包括 COPD。 当线粒体到细胞核的信号被激活时，它也会被释放。 在 COPD 中，在这里审查的所有 mitoquine 中，只有关于 GDF15 血液水平的信息，但文献中没有关于其他 mitoquine 水平的数据。 随着COPD的进展，线粒体血药浓度可能进行性升高，表现为线粒体功能的进一步恶化，虽然其水平只能升高到一定程度，当线粒体损伤难以忍受时又会降低，从而构成一种线粒体激素反应。 假设 线粒体功能障碍情况下表达的丝裂霉素在 COPD 患者中发生改变，并与最差的临床结果相关。 此外，米托喹可用作 COPD 的预后因素和潜在治疗靶点。 目标

1. - 描述对照组、一组稳定的 COPD 门诊患者和一组加重的 COPD 患者的米托喹水平。
2. - 描述不同 COPD 患者组的半音水平差异（不同程度的阻塞、高恶化风险与无恶化风险的患者、CAT 评分 <10 的患者与其他患者、低无脂肪患者）质量指数 (FFMI) 对比其他患者）。
3. -评估半音与不同临床结果（如 FFMI、6 分钟步行测试中的步行距离、FEV1、CAT 评分）之间的相关性。
4. - 评估米托喹是否可用于预测未来恶化和入院的风险。

方法

研究人群

纳入和排除标准：

稳定的 COPD 患者：将从医院的呼吸科门诊中选择

Universitario Marqués de Valdecilla。 慢性阻塞性肺病患者必须符合以下标准：

40 岁或以上，基线后支气管扩张剂用力呼气容积 1 秒 [FEV1]/用力肺活量 [FVC] ≤0.70。

COPD 恶化患者：将从 Universitario Marqués de Valdecilla 医院入院诊断为 COPD 恶化的患者中选择。

对照组：将从没有 COPD 或任何其他急性或慢性呼吸系统疾病的患者和患者亲属获得。

在双侧测试中接受 0.05 的 alpha 风险和 0.2 的 beta 风险 第一组需要 30 名受试者，第二组需要 90 名受试者才能发现具有统计学意义的比例差异预计在第 1 组中为 0.45，在第 2 组中为 0.1 . 预计辍学率为 5%。 ARCSINUS 近似。 该计算是根据我们小组先前发表的研究进行的。 我们计算了 120 名 COPD 患者、30 名 COPD 恶化患者和 30 名对照组的简单规模。

目标入组/样本量 180 预计入组率 25 名患者每月 预计研究开始日期：从 2019 年 12 月 1 日起在 Biobank 中收集的样本 样品送到生化实验室 01.03.2020 预计研究完成日期：（随访结束）05.04.2021 研究设计和方法 观察性前瞻性研究。 将从 COPD 门诊、戒烟门诊和因 COPD 恶化住院的患者中招募患者。 所有患者都将获得参与的书面知情同意书。 该研究已获得坎塔布里亚伦理委员会 (CEIC) 的批准。

参加者

1. 将在定期随访期间招募稳定的 COPD（40 岁或以上，基线后支气管扩张剂用力呼气容积 [FEV1]/用力肺活量 [FVC] ≤0.70）。
2. 对照组：年龄和性别匹配的志愿者，之前未诊断出 COPD 或其他呼吸系统疾病，并且支气管扩张剂后 1 秒用力呼气量 [FEV1]/用力肺活量 [FVC] >0.70。
3. COPD 加重患者：既往诊断为 COPD 的患者（40 岁或以上，基线使用支气管扩张剂后 1 秒用力呼气容积 [FEV1]/用力肺活量 [FVC] ≤0.70）因 COPD 加重而入院肺科病房。

将记录研究中所有参与者的查尔森合并症指数。 研究前 1 个月出现急性加重的患者、研究期间或纳入期前 6 个月纳入肺康复的患者、伴有其他潜在肌肉减少症原因（恶性疾病、心力衰竭、甲状腺功能亢进或其他慢性破坏性疾病）的患者以及患有以下疾病的患者已知的慢性肾病或近期的急性肾损伤将被排除在研究之外。 血液样本和所有其他测量将在患者接受进入研究的同一天进行。

临床特征

在研究登记时，COPD 患者将分为不同的类别组：(1) 无症状患者（COPD 评估测试 [CAT] 评分 < 10）与有症状患者（CAT 评分≥10），(2) 无呼吸困难患者（改良医学研究委员会呼吸困难评分 [mMRC] < 2）与呼吸困难患者 (mMRC ≥ 2)、急性加重高风险患者（有 2 次或更多次急性加重需要使用抗生素或全身性类固醇治疗或之前至少住院一次的患者）年）与恶化患者的低风险，以及（4）前吸烟者与主动吸烟者。 进入研究后，将采集血液样本，并对患者进行为期 1 年的随访（6 个月后 1 次访视和 12 个月后 1 次访视），并前瞻性地记录病情加重和入院情况。 在随访期间，研究中的所有临床研究者都将不知道米托喹的结果。 在此期间，可能会出现肺部恶化的患者将被告知可以自由前往医院急诊科，医生团队将根据自己的临床标准自由决定是否住院。

根据米托喹水平，患者将分为两组：一组由米托喹水平最高四分位数内的患者组成，另一组将包括米托喹水平其他三个四分位数的患者。

测量 基础呼吸困难将使用 mMRC 呼吸困难量表记录。 CAT 分数将通过自填问卷记录。 以前的恶化将从研究中包括的患者的临床记录中记录下来。 将根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会 (ATS/ERS) 对所有受试者进行肺活量测定。

身体成分将通过生物电阻抗装置（OMROM BF511，Omrom，日本）进行估算，FFMI 将计算为 FFM 与身高（以米为单位）的平方之比。 6 分钟步行测试将根据美国胸科学会的方案进行：要求患者在 6 分钟内在 30 米的直线走廊中尽可能远地步行，不受任何干扰。 在测试结束时，将记录患者行走的距离和呼吸困难。 Humanin 和 MOTS-c 将通过 ELISA (Mybiosource)、FGF21 y GDF15 进行测量。 将通过 ELISA (Quantikine) 进行测量。 如果可能，Romo1 也将通过 ELISA 进行测量。 该研究将分为 3 次访问：访问 1：血样采集和临床特征。 第 2 次访视：第 1 次访视后 6 个月：第 1 次访视后病情加重和住院（次数和日期）。 第 3 次访视：第 1 次访视后 12 个月：第 2 次访视后病情加重和住院（次数和日期）。

研究终点 主要终点：米托喹可用于估计 COPD 患者的入院风险。

次要终点：

1. -米托喹可用于估计 COPD 患者的 COPD 恶化风险。
2. - COPD 患者的米托喹有所改变。
3. - 米托喹在 COPD 恶化中发生改变。
4. - 米托喹与不同的 COPD 变量（FEV1、FFMI..）相关。

统计计划或数据分析 对于正态分布数据，数据将以均值 ± SD 或非参数数据的中位数（四分位数间距）表示。 组间差异将使用参数数据的非配对 t 检验或非参数数据的 Mann-Whitney 检验进行分析。

使用参数数据的 Pearson (r) 相关系数或非参数数据的 Spearman 等级 (rs) 相关系数检查数据集之间的相关性。 正态分布将使用 Kolmogorov-Smirnov 检验进行检验。

Kaplan-Meier 估计将用于计算随着时间的推移参加活动的参与者的比例。 使用 Cox 比例风险分析的单变量和多变量分析将使用 PC 版 SPSS 软件版本 25.00 进行，以根据米托喹的基础水平分析第一事件的发展，并确定与恶化和住院相关的风险因素。 如果 p 值小于 0.05，则差异将被视为显着。 所有报告的 p 值都是双侧的。

局限性和伦理考虑 这是一项单中心研究，因此必须在多中心研究中进行复制，使用来自不同国家的更多患者。 尽管昂贵且复杂，但可以执行一些技术，例如肌肉活检、测力计、使用 CT 或穿梭测试量化肌肉质量，以便更好地了解这些患者的肌肉质量和功能。

预计这项研究不会对患者造成潜在伤害。 本研究经坎塔布里亚伦理委员会批准（代码：2018.276）。 虽然该研究由葛兰素史克公司 (GSK) 资助，但它是一项独立研究，研究人员不会获得任何经济补偿。